启动子

1.3.1 核心启动子的分类 集中型启动子可见于所有生物体基因组内，在较低等 的生物体内这种转录起始作用几乎是唯一的一种基因转录 起始机制。不过在脊椎动物体内，大约有70%的基因都受到 弥散型启动子的控制，这些基因常见于CpG岛内。一般来 说，集中型启动子主要见于受调控基因（regulation gene）, 而弥散型启动子多见于组成型基因（constitutive gen）。
1.3.2 核心启动子中重要元件 虽然在脊椎动物启动子中集中型启动子只占很小的比 例，但绝大部分对RNA聚合酶Ⅱ转录机制的研究都是在集 中型启动子上开展的，很少有人关注弥散型启动子，这主 要是因为受集中型启动子调控的基因在生物学中具有更加 重要的意义。 科学家们通过对集中型核心启动子（core promoter） 的分析发现了各种重要的基序，比如TATA盒、BRE”位于 TFⅡB”因子识别位点上游的一段序列、起始子、基序十 元件（MTE）、下游启动子元件（DPE）、下游核心元件 (DCE)以及X核心启动子元件1（XCPE1）等。与集中型启 动子不同，弥散型启动子一般都缺乏BRE、TATA、DPE和 MTE等基序。所以这两种启动子发挥作用的原理很有可能 存在根本性的差别。
图1：核心启动子机制图
弥散型核心启动子往往只含有集中型启动子部分的核心元件， 没有固定的核心元件及核心调控模式，其调控模式比集中型要复 杂得多。
图2.分散型核心启动子机制
1.4 研究启动子的意义
研究启动子的意义：研究启动子的功能序列对于基 因表达调控机制的研究具有十分重要的意义，能使外源 基因高效，准确，长期稳定地在目的部位表达的启动子 序列是基因治疗和基因工程研究的热点之一。
3.1.2 转录因子的验证
1. EMSA实验在体外验证顺式作用元件同反式作用因子的结合
反式作用因子一般指的就是转录因子,顺式作用元件一般 是指转录因子和启动子结合的那部分序列,一般是10-20bp左 右.点突变证实该顺式作用元件对于启动子活性是有影响的, 接下来就要用EMSA实验验证反式作用因子和该顺式作用元件 在体外是有直接结合的,反式作用因子可以用细胞核抽提物做， 也可以用体外表达纯化的蛋白，也可以用该反式作用因子的 抗体做Super shift 实验，进一步证实该证顺式作用元件同 反式作用因子的特异性结合。
研究人员还发现，即使是同一个启动子，根据读 取遗传信息的起始点不同，转录出的 RNA 种类也存 在差异。研究显示，拥有多个起始点的启动子约占启 动子总数的 77%。或两种以上的顺式元件，这些元件 的种类、数量以及彼此之间的顺序与距离都可能影响 基因的转录与否或转录程度。
1.3 核心启动子的介绍
核心启动子：RNA聚合酶与转录起始复合物集合的部位。 分为集中型和分散型。在集中型转录起始作用里，基因转录 从一个或很少几个核苷酸位点处开始；而在弥散型转录起始 作用里，在一段长约50-100bp的“广阔范围”里会同时存在 好几个转录起始位点，不过每一个转录起始位点的转录起始 作用都比较弱，有一些启动子同时具有这两种转录起始作用。
3.2 预测保守基序
如果不能确定该基因启动子的转录因子和顺式作 用元件，可以通过启动子中保守的模块进行缺失。该 方法利用物种之间的序列比对，找寻序列中保守的模 块进行缺失。（http://meme.nbcr.net/meme/）
填入所要比对的序列
ຫໍສະໝຸດ Baidu
相同颜色的方块为相同的基序，可以根据相同模块所在 的位置对启动子进行缺失。
2012.11.22
一.启动子相关介绍
1.1 启动子的概念
启动子：一段能被RNA聚合酶特异性识别和结合，能正 确有效的起始转录的一段DNA调控序列，一般位于基因5端 上游区域。真核生物具有三种RNA聚合酶，而RNA 聚合酶Ⅱ 型启动子在真核生物中最为常见，也最为复杂。有多复杂？ 比如，有包括TATA框、GC框等多种元件；比如存在远端调 控序列；比如通过多种转录因子间接与RNA聚合酶结合。
二 启动子区域的查找以及分析
2.1克隆全长启动子
2.1.1利用数据库查找所要研究的启动子。 通常情况下，我们认为启动子区域在基因翻译起始位点ATG 往前大约2000bp。根据研究，有些重要的调控元件也存在于第 一外显子内，一般在ATG的下游再取200bp。 首先介绍利用NCBI数据库进行查询。
41640324代表ATG所在的位置
欢迎讨论!
应用UCSC/Ensembl查找基因启动子(promoter) 网址：http://genome.ucsc.edu
2.2 启动子的甲基化预测
CpG岛(CpG island)：CpG双核苷酸在人类基因组中的 分布很不均一，而在基因组的某些区段，CpG保持或高于正 常概率，这些区段被称作CpG岛,在哺乳动物基因组中的1-2kb的DNA片段，它富含非甲基化的CpG双倍体。CpG岛主要 位于基因的启动子（promotor）和第一外显子区域，约有 60%以上基因的启动子含有CpG岛。GC含量大于50%,长度超 过200bp。 CpG岛经常出现在真核生物的house-keeping基因的调控 区，在其它地方出现时会由于CpG中的C易被甲基化而形成 5'-甲基胞嘧啶，脱氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身就会 存在于DNA中，因此不易被修复，所以被淘汰。故CpG在 基因组中是以岛的形式分布的。
红框内为预测的CpG岛，在进行缺失实验时，可以保留此区域的完整性。
3 缺失片段的构建
1 利用文献中报道的顺式作用元件和转录因子进行缺失； 2 利用物种之间一些保守的模块或基序对启动子进行缺失。
3.1 顺式作用元件的预测
得到启动子序列后,克隆进没有启动子载体pGL3或者 pTAL-luc中去，转染细胞, 测定荧光活性，如果有很强的活 性,那么说明你已经成功克隆到了该基因的基本启动子然后可 以通过5‘非翻译区一系列的缺失突变，不断把范围缩小,找 到一段最短且具有基本调控功能的启动子区域。 可以通过一些顺式作用元件的预测对启动子进行缺失。 利用在线的软件预测顺式作用元件的位点,每个在线软件都有 自己独特的算法分析,得到的结果并不都是可靠的,每个软件 都有自己的优势，需要多综合一些软件预测的结果,并通过分 析预测出来的转录因子是不是和该基因有功能上的联系等做 进一步的选择，继续做下面的验证实验。
2. CHIP实验在体内验证顺式作用元件同反式作用因子的结合
当EMSA实验得到阳性结果后,还是不能最后肯定该反式作 用因子和该顺式作用元件有结合.毕竟体外的结合并不能代表 生理条件下的结合.接下来就要用染色质免疫沉淀(ChIP) 技 术来证实在体内的生理条件下该顺式作用元件和该反式作用 因子是有结合的.
3.1.1 转录因子的查找
下面为免费预测网站： http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html http://www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess 以TESS为例预测转录因子
同样在首页，通过下面的方框，你可以查找一些转录因子的 相关信息。
启动子是在DNA转录为RNA这一步过程中发挥作用的， 在此要与DNA自身复制起始点（称作复制子）和由mRNA翻译 为蛋白质时的翻译起始点（以起始密码子ATG为标志）区别 开来。
1.2 启动子的认识
传统的启动子理论认为人类每个基因平均拥有约一 个启动子且启动子上供读取信息的起始点只有一个、一 个启动子只能转录出一种 RNA 。然而，来自日本理化 研究所等机构的研究人员近日在《自然·遗传学》杂志 上发表论文说，他们分析了约 1400 万条 RNA 链，并 以此为线索研究这些 RNA 链是从 DNA 的哪个部位开始 转录而成的。研究人员在此基础上确定，人类 DNA 拥 有的启动子数量超过 19 万个，平均每个基因至少有 5 个启动子。
CpG表示核苷酸对，其中G在DNA链中紧随C后。CpG对很 少出现在人类基因中。然而，在许多基因的启动子（promotor） 或“起始”区域周围，甲基化经常被抑制。这些区域包含浓度 相对较高的CpG对，与此段区域对应的染色体区段一起被称作 CpG岛。 CpG岛所在的位置，有可能是核心启动子存在的区域。 预测网站http://www.urogene.org/cgibin/methprimer/methprimer.cgi