SDSPAGE测量蛋白质分子量解析

<104 104-105 105-2×106
20-30 15-20 10-15 5-10
2-5
10-20 5-10 2-2.5
5%
10%
Fra Baidu bibliotek
15%
200
200
200
97
97
66
97
66
66
45
45
29 29
45
29
迁 移
A
率
B
5 7 9 11 13 15 T%
凝胶浓度T对样品迁移率的影响
例：混合蛋白质A,B，A分子量较小，B分子带电荷较多，T＝5％ 时，电泳行为主要以电荷起作用，B 迁移速度快。当 T 增加，分 子筛效应增加，B的迁移速度减慢；T＝ 9 ％时，A，B的迁移率 相同，不能分开，T 再增加，凝胶孔径更小，A分子比B分子小， 表现较高的迁移率。并且说明电泳只获得单一的带时，并不能证 明是单一的均一成分。
C
a＋ bb10（0 ％）T
ab10(0％ ）
m
上式中a为丙烯酰胺的克数，b为甲叉双丙烯酰胺的克数，m 为水或缓冲液体积（ml）。式中a与b的比例很重要。富有 弹性，且完全透明的凝胶，a与b的重量比应在30左右。
分子量范围与凝胶浓度的关系
物质 蛋白质
核酸
分子量范围 适用的凝胶浓度（%）
<104 1-4×104 4×104-1×105 1-5×105 >5×105
不连续凝胶电泳（disc）的分离原理
(一).原理
不连续凝胶电泳系统具有与一般电泳的① 电荷效应分离 外，还具有②浓缩效应与③分子筛效应，因而，能提高 电泳的分辨率；使电荷性质与密度相近的但分子量有差 别的分子得以分离；或分子量相近、性质一样、电荷性 质与密度有差别的分子可以分离；或电荷性质、分子量 大小相近，但构型不同时亦可分离。
0.025mol/L Tris（三羟甲基氨基甲烷） 0.2mol/Gly (甘 氨酸) PH8.3 样品缓冲液 0.1mol/L Tris-HCl,PH 6.8, 40%甘油、0.05mg/ml溴酚蓝 样品缓冲液的要求： 选择合适的PH与离子强度，以保证样品的溶解性、稳定性、 生物活性。并加入便于观察电泳前沿的指示剂。
比。
6. 聚丙烯酰胺凝胶优点
7. 化学性质稳定；凝胶孔径可调； 8. 重复性好；分辨率高； 9. 灵敏度高，可以测定10-6浓度的样品。
T ab10(0％ m
C b 100％ 1 ab
凝胶浓度的计算
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶的强度、弹性、透明度、粘度和孔 径大小均取决于两个重要参数T和C，T是丙烯酰胺和甲叉双 丙烯酰胺两个单体的总百分浓度。C是与T有关的交联百分 浓度。T与C的计算公式是：
加样
电泳
光吸收
检测
考玛斯亮篮染色
染色
银 染色
SDS-PAGE测蛋白质分子量
SDS-PAGE是在PAG系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS能 断 裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能 使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的 SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质 复合 物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状 态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了 各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按 重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分 子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子 量 的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子 量，X 为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率 对 分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进
DMAPN
β－二甲基胺基丙晴
影响聚合因素
1. 大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程 中要使反应液与空气隔绝。
2. 某些材料如有机玻璃，能抑制聚合反应。 3. 某些化学药物可以减慢反应速度，如赤血盐。 4. 温度高聚合快，温度低聚合慢。 5. 碱性条件下凝胶易聚合，其聚合速度与AP浓度的平方根成正
2.缓冲液的组成:图示。PH系统的不连续， 各种分子的电荷之间的差异进行分离。
3.缓冲体系的不连续，其中各组成的离子、 快慢离子迁移快慢的差别是影响样品浓 缩效应的重要因素。
4.离子的迁移速率及浓度的不连续又造成 电场强度与电导率的变化。
②分子筛效应
移动界面到达浓缩胶和分离胶 界面时，凝胶的PH变化明显， 缓冲液中甘氨酸的解离迅速增 加，直至完全解离出 gly-,其 分子量小，迁移超过蛋白质分 子。而丧失夹击的作用；同时， 凝胶的孔径变小，降低了蛋白 质的迁移率。故蛋白质分子在 均一的电压梯度和PH 值中泳 动，依其分子量的大小而分开。
EXPERIMENT 7
SDS-PAGE测 量
蛋白质分子量
实验目的
学习聚丙烯酰胺凝胶聚合原理； 学习不连续聚丙烯酰胺凝胶分离原理； 掌握垂直板电泳的操作方法； 学习SDS-PAGE测蛋白分子量原理并测定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳—
PAGE (Polyacryamide gel electrophoresis)
③电荷效应
操作
PH8.3 PH6.7 PH8.9 PH8.3
1. 垂直柱状，板状 的不连续凝胶电泳 系统的组成和配制
1. 垂直柱状，板状的不连 续凝胶电泳系统的组成 和配制；
2. 均一凝胶与梯度凝胶配 制；
3. 电极缓冲液系统；
4. 样品的准备；
5. 加样要求
6. 电泳
7. 检测
缓冲液系统
浓缩凝胶缓冲液 0.5mol/L Tris-HCl,PH6.8 分离凝胶缓冲液 1.5mol/L Tris-HCl,PH8.8 电极缓冲液系统
标准蛋白质样品
标准蛋白质样品：是一组（5～7种） 已知的合适的分子量范围的、构形 相近的一套蛋白质，溶解在样品缓 冲液中备用。
样品的浓度 分析目的、检测方法和样品的组成
是关键； 未知样品浓度：0.1～20mg/ml 考玛斯亮篮染色：1～2mg/ml 银 染 色 :0.02～0.2mg/ml 高纯度样品： 0.5～2mg/ml
支持介质－聚丙烯酰胺凝胶
聚合原理：
单体丙烯酰胺Acr
交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺Bis
化学聚合
光聚合
引发剂 加速剂
（NH4)2S2O8 TEMED
（NH4)2S2O8 DMAPN
核黄素 TEMED
注： （NH4)2S2O8
TEMED
过硫酸胺在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递， 使丙烯酰胺 成为自由基，发动聚合反应 N，N，N，N-四甲基乙二胺
不连续凝胶电泳洗脱
碱性不连续－分离酸性样品
酸性不连续－分离碱性样品
大多数蛋白质分子呈酸性或中性，适合用碱性系统进 行电泳分离。
①浓缩效应
1.凝胶的组成：浓缩胶为大孔径（稀） T ＜5％，分离胶一般为小孔径（浓） T﹥7.5％。样品在较稀的凝胶上自由迁 移，直至浓凝胶时，便形成一道栅栏， 所有的样品分子在浓缩胶的界面堆积成 一窄带，得到浓缩，然后，再依据分子 量的大小进行电泳分离。