蛋白质的提取与分离纯化——生化实验设计讲解完整ppt课件

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三、蛋白质粗提取
步骤原：理：利用蛋白质在PH等电点时的溶 1．解向度试最管小中加，入因磷而酸会氢以二沉钠淀和柠的檬方酸式，析使出其。PH=4。 2．试将剂提：取柠的溶檬液酸加、入磷到酸第氢1步二骤钠所配的缓冲液中。
3．静置一段时间，待沉淀完全。 4．过滤或离心出粗产品。 注意事项：防止局部过酸或过碱造成蛋白质变性。
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第三组组员：
生化实验设计
——蛋白质主的讲提人取： 与分离纯化
华中师范大学化学学院
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已知某蛋白的分子量约为17 kDa，等电点 3.9~4.1，它能耐一定的高温，在90 C加热 3~4 min后仍然能够保持80%的活性。该蛋白 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合后可以暴 露它的疏水基团。该蛋白的作用是作为生物体 内酶的激活剂。请设计一个从脑组织中提取和 分离纯化该蛋白的实验方案，要求写出具体的 步骤和理由，以及检测方法。
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当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁 移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX，
式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常 数若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子 量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质 在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即 可在标准曲线上求得分子量。
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文献查得： 钙调蛋白（CaM）是由148个氨基
酸组成的单链分子,其pI值在3.9-4.1之 间,分子量约为17KDa.该蛋白能够耐一 定的高温，在90oC加热3-4min后仍然 能够保持80%的活性。该蛋白分子中 含有较多的疏水性残基，与Ca2+结合 后可以暴露出它的疏水基团。
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整个实验过程一般可分为 5 个阶段：
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B、定量分析
紫外检测法、考马斯亮蓝法、Folin-酚试剂法（最常用方法）
Folin-酚试剂法包括两步反应：第一步是在碱性条件下， 蛋白质与铜作用生成蛋白质-铜络合物；第二步是此络合物
将磷钼酸-磷钨酸试剂（Folin 试剂）还原，产生深蓝色 （磷钼蓝和磷钨蓝混合物），颜色深浅与蛋白质含量成正 比。此法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100 倍，定量范 围为5～100μg 蛋白质。Folin 试剂显色反应由酪氨酸、色 氨酸和半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和 巯基化合物均有干扰作用。此外，不同蛋白质因酪氨酸、 色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。
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五、分析鉴定
A、定性分析
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量：是在聚 丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂 分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能 使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋 白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了 原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从 而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS 与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳·时，蛋白质 分子的迁移速度取决于分子大小。
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值得注意的是，在洗脱时，会有少许配基与蛋白 质一同被洗脱下来，因此常在其后加一凝胶层析 以除去小分子的配基。
凝胶层析法属最常用的蛋白质分离方法。系混合
物随流动相流经装有凝胶作为固定相的层析柱时， 混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术。 在洗柱过程中，分子量最大的物质不能进入凝胶 网孔而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外。分子 量最小的物质因能进入凝胶网孔而受阻滞，流速 缓慢，致使最后流出柱外。
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四、精细纯化
金属螯合亲和层析
固定化金属螯合亲和层析是建立在蛋白质表面 的氨基酸与固定化金属离子的亲和力的不同来进行 蛋白质分离的一项技术。过渡态金属离子能够与电 子供体，如氮、硫、氧等原子以配位键结合，金属 离子上剩余的空轨道是电子供体的配位点，当它在 溶液中会被水分子或阴离子占据。
钙调蛋白的外形似哑铃,有两个球形的末端,中 间被一个长而富有弹性的螺旋结构相连,每个末端 有两个Ca2+ 结构域,每个结构域可以结合一个Ca2+ , 这样,一个钙调蛋白可以结合4个Ca2+ ,钙调蛋白与 Ca2+ 结合后的构型相当稳定 。
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玻璃匀浆机
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b、细胞器的分离
细胞器的分离一般采用差速离心法。细 胞经过破碎后，在适当介质中进行差速 离心。
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三、蛋白质粗提取
从破碎材料或细胞器提出的蛋白质是不纯的， 需进一步纯化。纯化包括将蛋白质与非蛋白质 分开，将各种不同的蛋白质分开。选择提取条 件时，就要考虑尽量除去非蛋白质。一般总是 有其它物质伴随混入提取液中。但有些杂质 （如脂肪）以事先除去为宜。先除去便于以后 操作。常用有机溶剂提取除去。
①材料的选择和预处理 ②细胞的破碎（有时需 进行细胞器的分离）③提取 ④纯化（包括等电 点沉降法，盐析，有机溶剂沉淀，吸附、层析、 等）⑤分析鉴定。
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实验步骤：
一、材料的选定：大鼠脑组织 预处理： 将切取的组织用4℃预
冷的0.01mol/l的PBS漂洗去血渍，再 用滤纸吸干残留的PBS（磷酸盐缓冲 液）。
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二、a 细胞的破碎
⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破 坏。常用器械有： ①玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互 摩擦，将细胞磨碎） ②高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动 物内脏组织的破碎 ⑵物理方法 主要通过各种物理因素的作用，使组织 细胞破碎的方法。 Ⅰ反复冻融法 Ⅱ冷热变替法 Ⅲ超 声波法 ⑶化学及生物化学方法