发酵工程第四章发酵工业的无菌技术

4）污染的杂菌大量繁殖，会改变反应介质的pH ，从而使生物化学反应发生异常变化；
5 ）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解而使生
产失败等。
A．细菌

谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不 太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。

肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基 丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重 抑制菌生长和合成代谢产物。
以提前放罐。
（3）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响
染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，
所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导
致过滤困难。
污染杂菌的种类对过滤的影响程度有差异，如 污染霉菌时，影响较小，而污染细菌时很难过
滤。由于过滤困难，过滤时间拉长，影响发酵
板
法
上层平板
宿主菌悬液（对数期菌液0.2mL） 噬菌体试样（合适稀释液0.1mL） 37℃ 计数噬菌斑 10余h
溶解氧水平的异常变化
感染噬菌体，生产菌的作用受到抑制，溶氧浓 度很快上升。 污染好氧性杂菌，溶解氧在短时间内下降，并
接近零值，长时间不能回升；
污染非好氧性杂菌，生产菌受到抑制，耗氧量
不彻底、操作不当或空气带菌；
发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操
作问题。
3）从wenku.baidu.com菌程度分析
多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题；
个别罐染菌：设备问题、操作不当。

（1）种子带菌及其防治—发酵前期 种子带菌又分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。
加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌是可以
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
（4）灭菌不彻底
灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 升温快慢、保温时间,泡沫
蒸汽总压是否达到要求标准
环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。如上海第 四制药厂在卡那霉素生产中，于炎热的夏季将连续 灭菌预热至80℃的培养基采样培养，可发现无法计 数的大量的芽孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则 仅发现2～3个芽孢杆菌。


控制有害微生物主要有以下几种措施：
杀灭一切微生物
杀灭病原微生物
比较项目
处理因素
灭菌
消毒
防腐
化疗
强、理化因 理、化因素 素
理、化因素 化学治疗剂
处理对象
任何物体内 生物体表， 外 酒、乳等
有机物体内 宿主体内 外 一切微生物 有关病原菌
抑制或杀死 抑制或杀死 冷藏、干燥、抗生素、磺 糖渍、盐腌、胺药、生物 缺氧、化学 药物素 防腐剂
液储罐和过滤设备的周转使用，破坏了生产平 衡。染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度降低 过滤收率，直接影响提取总收率。

丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶， 发酵液粘度增加，过滤困难 预处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮
凝剂使蛋白质凝聚后沉淀

杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶 媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生 乳化
微生物类型 一切微生物 有关病原菌
对微生物作 彻底杀灭 用 实例 杀死或抑制
加压蒸气灭 70%酒精消 菌，辐射灭 毒、巴氏消 菌、化学杀 毒法 菌剂
什么是染菌？
发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌 生长繁殖。
4.2.1 杂菌污染的危害
1）由于杂菌污染，使发酵培养基因杂菌的消耗 而损失，造成产率的下降； 2）由于杂菌所产生的某些代谢产物，或染菌后 发酵液某些理化性质的改变，使产物的提取 变得困难，造成得率降低或使产品质量下降； 3）污染的杂菌可能会分解产物而使生产失败；
措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变化情 况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放罐，或者 抗生素生产中可以将高单位的发酵液输送一部分到染 菌罐，抑制杂菌。
4）发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产物，
特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀
灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响
不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可
2）辐射灭菌：
利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀灭微生物。
如紫外线（穿透力低，仅适用于表面消毒和空气消
毒）与菌体核酸的光化学反应而使菌体死亡；0.01-
0.14nm的X射线、Co60产生的γ射线，它们含极高的
能量，可使菌体内的水和有机物产生强烈的离子化 反应，形成OH-、H2O2和有机过氧化物，从而在微 生物体内引起氧化连锁反应，导致微生物菌体迅速 死亡。近年兴起了微波灭菌。

显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断 › DO2水平异常变化 › pH异常变化 › 尾气CO2异常变化
双
底层平板（2％琼脂培养基10mL）
层
平
上层培养基（1％琼脂培养基5mL） 混匀
减少，溶解氧升高。
1
2
尾气中CO2含量异常
污染杂菌，糖耗加快，CO2含量增加；感染 噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。
pH异常
对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快 的杂菌，会使pH迅速下降。

主要原因：
① 种子带菌
② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善

青霉素：怕染细短产气杆菌


链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌
四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌


柠檬酸：怕染青霉菌
肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌

谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
C.
D.
酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌
疫苗生产:危害很大,现在疫苗多采用深
层培养，这是一类不加提纯而直接使用的 产品，在其深层培养过程中，一旦污染杂 菌，不论死菌、活菌或内外毒素，都应全
（2）过滤空气带菌及其防治 从日本工业技术院分析空气带菌而造成的 染菌为19.96％。国内外空气除菌技术虽已有
较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想
的程度。因为空气除菌系统较为复杂，环节 多，不慎便会导致空气除菌失败。

正确选择采气口


保持过滤介质的干燥
设计和安装合理的空气过滤器
（3）设备渗漏或“死角” 设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管 穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏和其它
措施 如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可 以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。
3）发酵中期染菌
发酵中期染菌，处理困难，危害很大。
发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量 产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘， 菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产 生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡 沫。
（2）不同发酵时期染菌对发酵的影响
1）种子培养期染菌
由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势
，而且培养基营养丰富，容易污染杂菌。种子 染菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌， 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
2）发酵前期染菌
发酵前期最易染菌。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势 ；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌 能力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。
部废弃。因此，发酵罐容积越大，污染杂
菌后的损失也越大。
污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫， 即使添加消泡剂也无法控制逃液，影响发酵 过程的通气搅拌。 有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH 下降，使不耐酸的产品破坏。特别是染芽孢 杆菌，由于芽孢耐热，不易杀死，往往一次 染菌后会反复染菌。
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水溶性蛋白 和其它杂质。
采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发生乳化，
很难使水相和溶剂相分离，影响进一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如链霉素、 庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在离子交换树脂表面 ，或被离子交换树脂吸附，大大降低离子交换树脂的 交换容量，而且有的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时 与产物一起进入洗脱液，影响进一步提纯。
3）过滤除菌法 适用于澄清液体和气体的除菌。是将液体
设备漏等。从日本工业技术院发酵研究所对染
菌原因分析发现，这类染菌占33.85％。所以 说加强设备本身及附属零部件的严密度检查， 对制服染菌是极其主要的，也是重要的。







好气性机械搅拌发酵罐是密封 式受压设备，主要部件包括： 罐身 轴封 消泡器 搅拌器 联轴器 中间轴承 挡板 空气分布管 换热装臵 人孔以及管路等
1）从污染杂菌的种类分析
污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底； 污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、
设备渗漏或操作问题；
污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；
污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；
污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。
2）从污染时间分析
发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌
克服的。种子培养过程染菌与发酵一样有许多因素造 成。

培养基及器具彻底灭菌—灭菌锅使用


避免菌种在移接过程中受污染—无菌室
避免菌种在培养过程或保藏过程中受杂菌污 染
无菌室要求
在无菌室中装有紫外灯，打开紫外灯，照半小 时，关灯后15分钟再接种。 用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦桌子、 拖地. 接种时必须在超净台上操作，超净台装有一台 鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有高效过 滤器，保证无菌风从超净台吹出，外界有菌空气 不可能进入接种区域，保证无菌条件。 接种人员必须穿好无菌服，戴好口罩，手用酒 精棉球擦干净。

1）化学试剂灭菌法：

常用试剂有甲醛、氯气（或次氯酸钠）、高锰酸钾、 环氧乙烷、季铵盐（如新洁尔灭）、臭氧等。这些 物质易与微生物细胞中的一些成分产生化学反应，
如使蛋白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而
杀灭微生物。

由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用，而
且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基的灭 菌，但染菌后的培养基可用化学药剂处理。
日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析 项目 百分率% 种子带菌或怀疑种子带菌 9.64 接种时罐压跌零 0.19 培养基灭菌不透 0.79 总空气系统有菌 19.96 泡沫冒顶 0.48 夹套穿孔 12.36 盘管穿孔 5.89 接种管穿孔 0.39 阀门渗漏 1.45 搅拌轴密封渗漏 2.09 罐盖漏 1.54 其它设备渗漏 10.13 操作原因 10.15 原因不明 24.94
B. 霉菌

PenG ： 绝大多数杂菌都能直接产生青霉素酶，
而另一些杂菌则可被青霉素诱导而产生青霉素酶。
不论在发酵前期、中期或后期，染有能产生青霉 素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。

青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所 获。

柠檬酸： pH2.0 ，不易染菌，主要防止前期染菌。
链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成 不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养，干扰 生产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。

灭菌 (sterilization): 用化学或物理方法杀 死物料或设备中所有有生命物质的过程。

消毒 (disinfection): 用物理或化学方法杀死 空气、地表以及容器和器具表面的微生物。
除菌 (degermation): 用过滤方法除去空气或 液体中的微生物及其孢子。 防腐 (antisepsis): 用物理或化学方法杀死 或抑制微生物的生长和繁殖 。

培养基与设备灭菌不彻底的防治
› 原料性状：大颗粒的原料过筛除去 › 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气 › 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂
防止泡沫升顶
› 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置
› 灭菌后期罐压骤变
› 死角
› 操作不当造成染菌
› 噬菌体染菌及其防治
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法

发酵罐的“死角”
法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌
轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、 进料管口
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀

管道安装不当或配臵不合理形成的“死角”