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项目四 发酵工业的无菌操作

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第四章发酵工业的无菌技术

第四章发酵工业的无菌技术
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
喷淋冷却连续灭菌流程
蒸汽
蒸汽
放汽
冷却水
无菌培养基 进发酵罐
配料罐
连消泵 连消塔
维持罐
冷却罐
生培养基
真空冷却器 无菌培养基进发酵罐
分批灭菌与连续灭菌的比较
连续灭菌的优点：（适用于大型罐） 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有 利于提高发酵产率； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均衡； 采用板式换热器时，可节约大量能量； 适宜采用自动控制，劳动强度小； 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同 温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐

第四章-发酵工业的无菌技术

第四章-发酵工业的无菌技术

2024/7/17
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（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
种子扩大时期染菌:
易染菌、应灭菌后除去，并对种子罐、管道进行检查和彻底灭菌。
发酵前期染菌： 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据 各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵
=20.34(min)
由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著，故实际保 温阶段时间比计算值要短。
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（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。
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2. 污染原因分析
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关； 后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同 一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设 备问题。
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3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作 可靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治（第五节“空气除菌”） 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
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4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术

4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染

发酵工业的无菌技术课件

发酵工业的无菌技术课件

（2）污染其它杂菌 有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫，即使添加 消泡剂也无法控制逃液，影响发酵过程的通气搅拌。
有的杂菌会使发酵液发臭、发酸，致使pH下降，使不 耐酸的产品破坏。特别是染芽孢杆菌，由于芽孢耐热， 不易杀死，往往一次染菌后会反复染菌。
发酵工业的无菌技术
3、不同时间染菌对发酵的影响 污染时间是指用无菌检测方法确准的污染 时间，不是杂菌窜入培养液的时间。
• 管道安装不当或配置不发合酵工理业的形无菌技成术 的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
发酵工业的无菌技术
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
发酵工业的无菌技术
法兰连接不气带菌 因为空气除菌系统较为复杂，环节多，偶遇不 慎便会导致空气除菌失败。
同 产
素迅速破坏。
品 链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不
象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造
成不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干
扰生产菌的正常代谢、改变pH，降低产量。
发酵工业的无菌技术
灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑制
霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
不
同 产
疫苗生产危害很大。
品
发酵工业的无菌技术
3、种子带菌 分为种子本身带菌和种子培养过程中染菌。 加强种子管理，严格无菌操作，种子本身带菌 是可以克服的。种子培养过程染菌与发酵一样 有许多因素造成。
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4、灭菌不彻底 灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间——产生过 多泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。故染菌率 因季节不同而发生明显变化。

发酵工业的无菌技术

发酵工业的无菌技术
发酵工业的无菌技术
（一）概述
空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要 求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期 170h，那么每个周期需通气量2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大气中约有103-104 个微生物。
发酵工业的无菌技术
分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
发酵工业的无菌技术
五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
发酵工业的无菌短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
发酵工业的无菌技术
（三）空气预处理
1. 原理： 除尘(外源空气的前处理)：防塞，提高过滤效率和滤 器寿命；措施：建吸风塔、粗过滤器（布袋过滤器、 填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高 效前置过滤器 降温：防烧伤介质及水分蒸发严重，对发酵不利 除油、除水：防塞（因油膜堵），防止过滤器长菌堵 塞（因水滴） 加热：保持相对湿度 稳压：防止压力波动，贮罐
发酵工业的无菌技术
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响

发酵工业的无菌技术

发酵工业的无菌技术
间 1.设备要求低，不需另外 1.培养基的营养物质损 加热、冷却装置。 失大，灭菌后培养基 歇 质量下降 灭 2.操作要求低，适合小批 量生产规模 2.发酵罐的利用率较低 菌
3.适合含大量固体物料的 3.不适合大规模生产的 灭菌 灭菌
作业

1、连续灭菌的流程与设备 2、对数残留定律 3、分批灭菌、连续灭菌 4、P273第8题
二、影响培养基灭菌的因素p68
杂菌的种类与数量 灭菌温度与时间 培养基成分 pH值 培养基中的颗粒 泡沫

培养基成分

油脂、糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性 在固形物含量高的情况下，灭菌温度可高些。 环境 耐热性 60～65℃便死亡
水
大肠杆菌
10％糖液
30％糖液
70℃，4～6min
喷射加热连续灭菌流程
薄板换热器连续灭菌流程

3、灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、 后的含菌数。

例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌， 灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有 2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为 15min-1，求灭菌所需的维持时间。
解：C0=2×105(个/ml)
Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml)
t=2.303 [lg(C0/Ct)] /k=2.303×lg[(2×105)/(2.5×10-11)]
/15 =2.37 min
间歇灭菌与连续灭菌的比较
优 点 缺 点
连 1.高温短时灭菌，培养基 1.设备复杂，操作麻烦, 营养成分损失少。 染菌机会多。 续 灭 2.发酵罐占用时间缩短， 2.不适合含大量固体物 利用率高。 料的灭菌。 菌

发酵工业的无菌技术

发酵工业的无菌技术

整理课件
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分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
整理课件
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五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
整理课件
1
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
整理课件
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一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命 物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具 表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
整理课件
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3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
整理课件
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min

发酵工业无菌技术应用

发酵工业无菌技术应用
优点 设备投资较少 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含 量较多时更为适宜 缺点 灭菌过程中蒸汽 用量变化大，造成 锅炉负荷波动大， 一般只限于中小型 发酵装置。
4.2.4 设备和管道的灭菌 1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的
空罐灭菌及管道灭菌 2、空气总过滤器和分过滤器灭菌 3、种子培养基实罐灭菌 4、发酵培养基实罐灭菌 5、发酵培养基连续灭菌 6、补料实罐灭菌
取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得
ln
N N0
K t
2
4.2.2 培养基灭菌温度和时间的选择 高温短时灭菌 4.2.3 培养基的灭菌方法 （1）分批灭菌
也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌，是 指将配制好的培养基输入发酵罐内，直接 通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭 菌的操作过程 。
3. 两级冷却、分离、加热的除菌流程 空气吸气口 粗过滤器 空压机 贮罐 冷却器 旋风分离器 冷却器 丝网分离器 加热器 总过滤器
三、提高过滤效率的措施 1. 减少进口空气的含菌数量 ① 正确选择进风口 ② 提高进口空气的采风位置，即高空采风 ③ 对压缩前的空气采用粗过滤处理 2. 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌 效率高的过滤介质 3. 针对不同地区设计合理的空气处理流程 4. 降低进入过滤器的空气相对湿度，保证过 滤介质在干燥状态下工作
表4-3 几种微生物对湿热的相对抵抗力
微生物名称 大肠杆菌 细菌芽孢 相对抵抗力 1 3 000 000 霉菌孢子 2～10 病毒 1～5
二、微生物的热死规律——对数残留定律 实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭 动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：

dN dt
kN
1
N：任一时刻的活菌数（个） t：灭菌时间（min） K：比热死速率常数（min-1）

发酵工程 4 发酵工业无菌技术

发酵工程 4 发酵工业无菌技术
对于污染产酸菌或利用碳源效率高生长较快 的杂菌，会使pH迅速下降。
❖ 尾气中CO2含量异常 污染杂菌，糖耗加快，CO2含量增加；感染
噬菌体，糖耗减慢，CO2含量减少。
2、污染的原因分析 染菌的原因复杂，包括种子带菌、空气带
菌、设备渗漏、培养基或补料液灭菌不彻底、 操作失误、技术管理不善等。
日本工业技术院发酵研究所多年来抗生素发酵染菌原因分析
3、不同发酵时期染菌对发酵的影响
（1）种子培养期染菌 ➢ 由于接种量较小，生产菌生长一开始不占优势，
而且培养基营养丰富，容易污染杂菌。种子染 菌对发酵危害极大，应严格控制种子染菌，如 在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
（2）发酵前期染菌
➢发酵前期最易染菌。
➢原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势； 且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能 力弱。在这个时期要特别警惕以防止染菌的发生。
➢空气冷却器的列管穿孔泄露，冷却水会渗入到空气中， 造成染菌。 ➢棉花-活性炭过滤器长期使用后，棉花和活性炭的体积 被压缩而松动，如果上下端棉花铺得厚薄不均，厚的一 边阻力大空气不畅通，薄的一边空气容易通过，久而久 之，薄的一边长期受空气顶吹而使棉花活性炭改变位置， 造成过滤器失效。 ➢过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿就会降低 或丧失过滤效能，灭菌完毕应立即缓慢通入压缩空气， 将水分吹干。
➢措施 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱 调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染 菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一 些营养，重新接种再用。
（3）发酵中期染菌
➢ 发酵中期染菌，处理困难，危害很大。
➢发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大量 产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵液发粘， 菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时甚至会使已产 生的产物分解。有时也会使发酵液发臭，产生大量泡 沫。

4.发酵工业无菌技术

4.发酵工业无菌技术

这样对于不同 N0 的培养基，其灭菌时间不 同，即 t = t (N0) 。
发酵工业无菌技术
根据
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
1 N t ln K N0
在给定的温度条件下，t 与 ln N0/N 呈直线 关系，其斜率为 -1/K ；当 N0 给定后，t 决 定于 K ；K 除了决定于菌体的种类及存在 形式外，还是温度的函数。
发酵工业无菌技术
四 发酵培养基及设备管道灭菌
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
发酵生产中主要采用湿热灭菌的方法
生产中需要解决的问题：
杀灭培养基中的杂菌 避免培养基中营养成分的破坏
发酵工业无菌技术
湿热灭菌原理
四 发 酵 培 养 基 及 设 备 管 道 灭 菌
微生物的热阻 表征不同微生物对热抵抗能力强弱的指标。 指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热 方式)下的致死时间。 每一种微生物都有一定的最适生长温度范围， 如一些嗜冷菌的最适温度为5～l 0℃；大多数 微生物的最适温度为25～37℃；另有一些嗜 热菌的最适温度为50～60℃。
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
发酵工业无菌技术
3.不同染菌的时间分析
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
种子阶段
发酵初期
发酵后期
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杂菌污染途径及预防
二 发 酵 工 业 污 染 的 防 治 策 略
1.种子带菌及防止： 带菌的原因 无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌 不彻底；操作不当。 种子带菌的防止 种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在 每次接种后应留取少量的种子悬浮液迚行平 板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂 菌。严格技术觃范种子培养的设备和装置

发酵工业无菌技术

发酵工业无菌技术

噬菌斑
• 发酵过程的异常现象观察法：
溶解氧水平 传感器取样分析 pH 尾气中CO2
其他：发酵液粘度、泡沫、颜色
污染原因分析
• 耐热芽孢杆菌，可能是培养基或设备灭菌不彻底 • 球菌、无芽孢等不耐热杂菌，可能是种子带菌、空气
除菌不彻底
• 浅绿色菌落杂菌，可能是冷却盘管渗漏 • 霉菌，一般是无菌室灭菌不彻底或无菌操作问题 • 酵母菌，主要是糖液灭菌不彻底，放置时间久
• 细菌发酵，发酵周期短，主要是防止噬菌体污染 • 霉菌发酵，发酵周期长，产物易降解。 • 酵母菌发酵，需特别防止：（1）生长较快的细 菌（2）野生酵母菌 • 疫苗发酵，通常采用基因工程菌。
杂菌污染的防治
• 显微镜检查法：
简单染色或革兰氏染色，是最常用的检查
杂菌的方法，但需要时间。
• 平板划线培养检查法：
灭菌。连续灭菌可在短时间内加热到保温的
温度，并且能很快地冷却，因此可在比间歇
灭菌更高的温度下进行灭菌，有利于减少营
养物质的损失。
• • • •
配料罐将培养基预热60-70℃。 连消塔（加热塔）使培养基迅速（20 s)升温（126-132℃）。 维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min. 冷却管：将培养基迅速冷却到40-50 ℃，输送到灭菌后的发 酵罐内
常用浓度
0.1-0.25% 2-5% 70-75% 1-5% 3-5% 1-2% （10-15mL/m3） 0.1-0.25%
常用方法
环境消毒可直接 用于粉体 器物浸泡30 min
2 醇类： 乙醇 3 酚类： 石碳酸 来苏尔 4 甲醛
5 铵盐 新洁而灭
空气消毒
皮肤、器械、环境消毒
加热熏蒸4h

发酵工业的无菌技术

发酵工业的无菌技术

污染的危害
1
污染的防治
2
二、发酵工业污染的防治策略
01
02

03
04
05
1.染菌的不良后果
A．细菌 谷氨酸(棒状杆菌)：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷（枯草杆菌）：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
染菌危害的具体分析 染菌对不同菌种发酵的影响
填料过滤器、油浴洗涤和水雾除尘装置等）、高效前置过滤器
两级冷却、加热除菌流程图(南方潮湿地区) 1-粗过滤器；2-空压机；3-贮罐；4，6-冷却器；5-旋风分离器；7-丝网分离器； 8-加热器；9-过滤器
冷热空气直接混合式空气除菌流程图 (中等湿含量地区) 1-粗过滤器；2-压缩机；3-贮罐；4-冷却器；5-丝网分离器；6-过滤器
升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式 ㏑(N/N0) =-kt 来粗略估算灭菌所需时间。
01
灭菌时间的估算
02
2.灭菌时间的估算
例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)] =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。

第四章 发酵工业的无菌技术

第四章 发酵工业的无菌技术

3 杂菌污染的途径及其预防


种子带菌及其防治 培养基及器具彻底灭 菌，避免菌种在移接过程中受污染，避 免菌种在培养过程中或保藏过程中受杂 菌污染 过滤空气带菌及其防治 正确选择采气口， 提高采气口的位置或安装前置粗过滤器， 提高空压机进口空气的洁净度。

根据发酵工厂所在地区的气候条件，设 计合理的空气预处理流程，尽可能减少 过滤空气的含油量和湿度，适当提高进 入过滤器的空气湿度，降低空气的相对 湿度，保持过滤介质的干燥状态。设计 和安装合理的空气过滤器，防止过滤器 失效，选用除菌效率高的过滤介质。


杀死微生物的极限温度称为致死温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需要 的时间称为致死时间。 在致死温度以上，温度越高，致死时间 越短。


微生物对热的抵抗力称为热阻，即指微 生物在某一条件下（主要是温度）的致 死时间。 相对热阻是指某一微生物在某一条件下 的致死时间与另一微生物在相同条件下 的致死时间之比。

平板划线培养检查法 先将待检样品在无 菌平板上划线，根据可能的污染类别分 别置于37、27℃下培养划线平板，以适 应嗜中温和低温菌的生长，一般在8h后 即可观察到是否有杂菌污染。

对于噬菌体检查，可采用双层平板培养 法，上层和下层同为肉汤琼脂培养基， 上层减少琼脂糖用量，先将灭菌的下层 培养基融化后倒入平板，凝固后再将上 层培养基溶解并保持40℃，加上生产菌 作为指示菌核待检测样品混合后迅速倒 在下层平板上。置培养箱保温培养经1220h培养，观察有无噬菌斑。
第四章 发酵工业的无菌技术



发酵工业的无菌处理 发酵工业污染的防治策略 发酵工业的无菌技术 发酵培养基及设备管道灭菌 空气除菌

第四章发酵工业的无菌技术

第四章发酵工业的无菌技术

将配置好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、 保温和冷却等灭菌过程。——高温短时
（三）连续灭菌（连消）
工艺流程 喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
2. 预处理流程设计的简繁关键：去湿问题
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 ∵ Φ后= ΦdPsd/Ps后
3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
分批灭菌与连续灭菌的比较
缺点： 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； 蒸汽波动时灭菌不彻底； 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时， 以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
五、空气除菌
（一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
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部分发酵罐染菌： 个别发酵罐连续染菌：设备渗漏
4.杂菌污染途径及预防
（1）种子带菌及其防止 原因
：菌种培养或保藏过程染菌、培养基及用具灭菌不彻底、菌种移接
过程污染
措施：

严格控制无菌室污染，严格无菌操作； 种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度； 培养和保存温度不宜有太大变化； 菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理 ；
霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
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从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
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1）从污染杂菌的种类分析
污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底； 污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、设
污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
噬菌体是病毒的一种，是一种极微
小的生物，体积是细菌的1/1000左
右，它可以通过细菌过滤器，只有
在电子显微镜下才能看到。
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消除潜在的污染隐患-1
涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行； 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需 在无菌的环境下操作。 生物安全柜和超净台应注意清洁和消毒；每年更换HEPA过滤膜。
B.
实罐灭菌时未充分排除罐内空气：造成假压，
升温时，应打开排气等阀门放气。
C.
连续灭菌时，蒸汽压力波动大，培养基未达到
灭 菌温度，导致灭菌不彻底。
D.设备和管道存在“死角”
死角：由于操作、设备结构、安装或人为造
成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能
充分到达预定应该到达的局部灭菌部位，从而不
能达到彻底灭菌的要求。
项目四 发酵工业的无菌操作
发酵工业污染的防治策略
发酵工业无菌操作的基本概念
发酵工业的无菌操作技术 发酵培养基及设备管道灭菌
空气除菌
一、发酵工业污染的防治策略
什么是染菌？
即“杂菌污染”，是指在发酵培养中侵入了除 菌种外，有碍生产的其他微生物。
（一）污染的危害
杂菌大量消耗培养基中的营养物质，使生产菌的生产能力下降
采用备用菌种或以无污染的适当菌龄的发酵罐内的发
酵液作为种子，接入新鲜培养基中进行发酵。
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（2）发酵前期染菌
发酵前期易染菌，且危害很大，需特别注意防止 一旦发现染菌，如原料营养还比较丰富，则进行重新灭 菌、接种发酵；如已消耗较多营养物质，则放掉部分料 液、补充新鲜培养基，重新灭菌、接种发酵。
噬菌体的防治
严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；
净化生产环境，消灭污染源；
保证纯种培养，严防种子本身带噬菌体，特别是溶源性
噬菌体；
轮换使用菌种或使用抗性菌株。
2、染菌的处理
染菌后处理
染菌后必须对所有相关原料、仪器设备、管道等进行彻 底灭菌。 尽量查明染菌原因，以免重复污染。


3.污染原因分析
谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
种子 培养期
发酵 前期
发酵 中期
发酵 后期
2.染菌发生的不同时期对发酵的影响
（1）种子培养期染菌
菌体浓度低、培养基营养丰富，较易染菌，应严格控 制。 若将污染的种子带入发酵罐，则损失更大，因此一经 发现，应立即灭菌丢弃，并对种子罐、管道等进行仔 细检查和彻底灭菌。
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消除潜在的污染隐患-7
高压灭菌后的枪头，务必烘干使用
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消除潜在的污染隐患-8
玻璃器皿特别是菌体培养用器具使用前用铝箔包裹后，在180℃干热灭菌。
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消除潜在的污染隐患-9
培养装置应经常清洗消毒；
水浴摇床中的水要经常更换，长时间不用要将水排空，擦拭干净放置。
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消除潜在的污染隐患-10
污染耐热芽孢杆菌：培养基或设备灭菌不彻底； 污染不耐热杂菌：种子带菌、空气除菌不彻底、
设备渗漏或操作问题；
污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；
污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；
污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。
（3）染菌的规模分析

大批量发酵罐染菌：种子、空气；
前期：种子带菌，灭菌问题； 中后期：空气带菌；
发酵过程的异常现象
菌体生长差；
pH值过高或过低； 溶解氧水平异常； 泡沫过多； 菌体浓度过高或过低； CO2排放异常
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体 正常发酵
溶氧浓度
污染嫌气性杂菌
发酵时间 正常发酵
污染好气性杂菌
发酵时间
CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律
污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加
1 2 加热灭菌法 辐射灭菌法 化学药品灭菌法 过滤除菌法
3
4
二、发酵工业无菌操作的基本概念
灭菌：用物理或化学的方法杀死物料或设备
中所有的微生物。
消毒：用物理或化学的方法杀死空气、地表
1.染菌对不同发酵过程的影响
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌

谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少
染杂菌，但噬菌体威胁大。

肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成
代谢产物。
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B.霉菌
PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发 酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。
对过滤的影响
染菌后特别是污染细菌后，发酵液一般发粘，导致过滤
困难。
可采取加热、添加助滤剂等措施，或加絮凝菌对产物提取和产品质量的影响
对提炼与产品质量的影响
染菌发酵液中含有较多水溶性蛋白和其它杂质。增加提 炼难度，增加产物提取成本，降低产物纯度。
二、杂菌污染的防治
发酵后期如染菌量不多，可继续发酵。如染菌严重，破坏
性较大，可提前放罐。
3.染菌程度对发酵的影响
发酵罐中的杂菌数量越多，即染菌程度越大，则对发酵 的危害越大。
如生产菌大量繁殖后，发酵物中含少量杂菌，如每升发
酵液中有1-2个杂菌，一般对发酵没有什么影响。
4.染菌对产物提取和产品质量的影响
4.染菌对产物提取和产品质量的影响
措施
选用优质材料、科学合理加工、经常检查。
（5）操作失误染菌及防止
淀粉原料采用实罐灭菌，大颗粒应先筛去，再搅拌均匀，
加入一定量淀粉酶液化或糖化后灭菌。
在灭菌升温时，要打开排气阀门，排尽罐内冷空气。
严防泡沫升顶，可添加消泡剂防止泡沫的大量产生。 严格控制灭菌温度，避免蒸汽压力的波动过大。
发酵过程越来越多采用自动控制，控制仪器如用化学试剂
灭菌时
培养时
在培养时最好使用无菌的棉塞（不要使用铝箔覆盖培养瓶）；不 要使用潮湿或脏的瓶塞。
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消除潜在的污染隐患-11
Centrifuge & it’s rotor
Stands
接触菌体频率高，空隙多容易隐匿菌体的器具要经常清洗消毒。
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消除潜在的污染隐患-12
反复使用的电击槽
脏的移液器 与噬菌体污染的培养液 接触过的电极或buffer
备渗漏或操作问题；
污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起；
污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题；
污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。
2）从污染时间分析
发酵前期染菌：种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底、操作
不当或空气带菌；
发酵后期染菌：中间补料污染、设备渗漏或操作问题。
3）从染菌程度分析
多个罐染菌：种子带菌、空气系统问题； 个别罐染菌：设备问题、操作不当。
菌体相关垃圾处理： 生物安全柜或处理菌体的超净台应配备密封垃圾桶，以防止污染源外泄；
带有菌体的垃圾要做到当日灭菌；
如果当日不能灭菌，应使用垃圾袋密封后放置。
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消除潜在的污染隐患-6
分光光度计周围： 菌体相关的废液建议收集到专门密闭容器，每日灭菌；

盛放过菌液的比色皿应注意清洗，清洗液同上处理。
灭菌，一定要彻底。
（6）噬菌体污染及其防治
染噬菌体对发酵的影响
发酵过程如受噬菌体侵染，一般发生溶菌，随之出现发酵 迟缓或停止，而且往往会反复连续感染，使生产无法进行， 甚至使种子全部丧失，对发酵威胁很大。

噬菌体污染根本原因
生产中把活菌体排放到环境中，造成了自然界中相应噬
菌体大量增殖。 这些噬菌体随风沙尘土和空气流动到处传播，有可能潜 入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子 罐、发酵罐。

常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角， 发酵罐罐底脓疱状积垢。
法兰连接不当造成的“死角”
2014-12-16
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2014-12-16
（4）设备渗漏染菌及防止
原因
发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，因加工制作不良 或遭受腐蚀等原因而形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
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消除潜在的污染隐患-2
使用胶头、移液器、电动移液器吸取溶液后，不能水平放 置，以防液体进入。 一旦液体进入要及时更换滤膜，并做好消毒措施。
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消除潜在的污染隐患-3
普通大肠杆菌的转化及划线后平板建议用石蜡膜完全密封后培养和放置。
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消除潜在的污染隐患-4

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