红花高效液相色谱指纹图谱的研究21页PPT

几种特征成分（如色谱指纹图谱）以保证制剂和产品质量的一致”［２］。

我国国家药品监督管理局２０００年颁布了《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》，要求到２００２年末，所有申报的中药注射剂均应有相关的指纹图谱资料，　使中药指纹图谱的研究成为中药研究的热点。

为实现中药材、中成药质量标准现代化，使中药走向世界，研究建立指纹图谱对实现中药质量标准现代化具有重要的意义。

２　高效液相色谱技术在中药指纹图谱研究中的应用２．１　高效液相色谱法构建中药指纹图谱应用于中药材的真伪鉴别及质量评价由于高效液相色谱仪的诸多优点并能对中药样品中含有的绝大多数成分进行分析检测及质量评价，故高效液相色谱技术已成为当前研究中药指纹图谱的主要手段。

欧洲国家现在普遍采用高效液相色谱法对植物药物中已知及未知组分进行控制，并形成相应的规范。

因此高效液相色谱法在构建中药指纹图谱对中药的定性鉴别与定量分析中得到广泛应用。

采用高效液相色谱法测定指纹图谱可对中药材的产地、采收时间、加工方法、工艺流程等多方面通过化学成分的差异来反映中药材的种属差异、真伪鉴别等，从而达到控制中药质量的目的。

刘梅［３］等采用ＨＰＬＣ色谱指纹图谱可以快速、准确对药材夏天无和延胡索进行定性鉴别。

张玉杰等［４］对不同产地正伪品沙苑子及伪品的主要有效成分黄酮类进行利用ＨＰＬＣ指纹图谱进行鉴别研究，研究显示不同来源的正品沙苑子ＨＰＬＣ指纹图谱十分相似，而２种伪品则显示出完全不同的指纹图谱特征，得出ＨＰＬＣ指纹图谱特征可以作为沙苑子质量评价和药材鉴别的依据。

李磊等［５］以不同产地正宗丹参和市场上充作丹参的其他鼠尾草属植物为分析对象，采用ＨＰＬＣ法构建丹参ＨＰＬＣ指纹图谱，可鉴别不同来源丹参与其他鼠尾草属丹参伪品。

高效液相色谱技术在中药指纹图谱研究中的应用许一平１ 罗启恩２１．山东中医药高等专科学校 ２６５２００２．莱阳农学院 ２６５２００高效液相色谱法（Ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＨＰＬＣ）是在经典液相色谱法的基础上发展起来的一种新的色谱技术。

关于红花药材高效液相色谱指纹图谱初步研究的综述摘要目的：利用高效液相色谱建立新疆地区红花的色谱指纹图谱。

方法：采用反相C18柱，乙腈一0．5％磷酸水溶液梯度洗脱；检测波长275 rim；流速1．0mIJmin进行试验。

结果：从7个地区出产的红花获得色谱共有峰，比较基本特征。

羟基红花黄色素A为指标成分，看哪个红花的含量为最高。

结论：该法为中药样品的鉴定提供了较全面的信息，红花样品指纹图谱及指标成分含量测定可用于全面控制红花药材的质量。

关键词红花；高效液相；指纹图谱前言：红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L. 的干燥花,具有活血通经、散瘀止痛的功效,是传统的活血化瘀中药现代药理研究表明红花对心血管系统有广泛而显著的作用,临床疗效确切,大量用于中成药生产和临床处方。

因此,建立红花药材有效的质量评价方法,对不同产地红花药材的质量进行系统的比较研究,确保红花药材质量稳定,直接关系到红花相关药品和临床处方的疗效。

谱指纹图谱用于中药的表征和质量控制已越来越引起广泛的关注。

色谱指纹图谱是在固定实验条件和实验方法，得到同一样品不同批次色谱图谱。

美国FDA最近几年制定的植物草药指南已把指纹图谱作为这类混合物质群的质量控制方法。

欧洲也将色谱指纹图谱作为植物药制剂的评价方法。

本文采用高效液相色谱法,建立红花药材的指纹图谱,对不同来源的红花药材进行比较研究,为红花的质量控制提供有效方法。

正文：1材料与仪器1．1仪器与试药Agilent一1100高效液相色谱仪；四元泵，DAD检测器；G137PA自动脱气机；标准自动进样器；柱温色谱柱Zorhax SB—C18柱(4．6mln×250 mln，5 tnn)。

乙腈为色谱纯(Fisher)；水为二次蒸馏水；羟基红花黄色素A对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0782—200310)；红花药材由武汉大学药学院张洪教鉴定为菊科植物红花能心地矾淞tinctorius L．的干燥花(符合中国药典2000年版一部)。

基于超高效液相色谱-质谱红花药材指纹图谱的建立罗春霞;王瑾;祁艳茹;马丽;杨亮;关明【摘要】以红花为研究对象,建立超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)指纹图谱分析方法,为红花药材质量鉴别提供借鉴.通过考察检测波长、梯度洗脱条件、提取溶剂、提取方法等因素,在最优条件下对20个产地的红花样品进行分离分析.色谱柱:Thermo Hypersil Gold C18,100 mm×2.1 mm,1.9μm,流动相:0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B);流速:0.3 mL/min;柱温:30℃;检测波长:270 nm;进样量:2μL,质谱条件:鞘气流速:45 arb,辅助气流速15 arb,雾化电压:3.3 KV,离子传输管温度:350℃,辅助气加热温度:400℃.试验结果:共确定了67个共有峰,通过UPLC-MS指认了其中11个共有峰,对20批不同产地的红花药材指纹图谱进行了相似度评价,其相似度在0.687～0.971之间.建立的UPLC-MS指纹图谱可为红花药材的质量控制提供参考依据.【期刊名称】《分析测试技术与仪器》【年(卷),期】2019(025)003【总页数】8页(P152-159)【关键词】超高效液相色谱-质谱;红花药材;指纹图谱【作者】罗春霞;王瑾;祁艳茹;马丽;杨亮;关明【作者单位】新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐 830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐 830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐 830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐 830054;新疆师范大学化学化工学院,新疆乌鲁木齐830054【正文语种】中文【中图分类】O657.63红花(Carthamus tinctorius L.)系菊科[1]，又名刺红花、草红花，一年或两年生草本植物. 红花是我国传统的中药材，具有活血化瘀、舒筋活络、预防和治疗心脑血管疾病等功效[2-4]. 新疆因具有特殊的地理环境和生态条件而成为我国红花的主产区[5]. 由于长期的自然选择和人工选择，红花种内产生了明显分化，形成了丰富的种质资源，不同种质来源的红花药材品质差异明显. 中药材的质量问题直接关系到中药的疗效及安全，因此建立一种反映中药内在质量的评价方法是关键.近年来，指纹图谱已广泛应用于药材的鉴别和质量评价[6-8]. 目前，关于红花指纹图谱的报道很多[5,9-11]，但有些来源地比较有限，有些指纹图谱共有峰较少，很难对红花药材的质量进行全面、客观的评价. 高效液相色谱(high performance chromatography, HPLC)法建立的中药指纹图谱存在灵敏度较低、溶剂消耗量大等问题，使中药中的组分不能被全部识别，进而导致药材质量评价不够准确. 近年来，超高液相色谱(ultra high performance liquid chromatography, UPLC)以其分析速度快、分离性能好等优点，在中药分析中快速发展[12]. 本研究以20批不同产地的红花药材为分析对象，构建红花药材多指标成分超高效液相色谱-质谱(ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry, UPLC-MS)指纹图谱，对20批红花药材进行相似度评价，较为客观地反映药材的内在质量，为新疆地域药材质量评价理论的完善和质量鉴别方法的建立提供一定的参考依据.1 试验部分1.1 仪器、试剂与材料UltiMate3000/QExactive超高效液相色谱质谱联用仪(Thermo Scientific)；色谱柱：Hypersil Gold C18，(100 mm×2.1 mm×1.9 μm，Thermo Scientific)；微波超声波合成萃取仪(北京祥鹄科技有限公司).甲醇、甲酸、乙腈(均为HPLC级，Fisher scientific公司)；试验用水(广州市屈臣氏牌纯净水).红花药材采自新疆不同产地，共20批，经新疆农业大学杨晓君副教授鉴定，为菊科红花属草红花. 自然晾干后粉碎，过180 μm筛，放入干燥器中室温下避光保存，样品信息如表1所列.表1 新疆不同地区红花药材采样点Table 1 Sampling sites of Carthamus tinctorius L. in different areas of Xinjiang序号来源地序号来源地1和田地区墨玉县阿克萨拉依乡11昌吉地区吉布库镇2伊犁地区察布查尔县扎格斯台12和田地区于田县郭家屯乡3伊犁地区尼勒克乡13塔城地区塔城市164团4伊犁地区喀什乡14昌吉地区吉木萨尔镇5伊犁地区清水河农科站15昌吉地区吉木萨尔县北庭镇6伊犁地区霍城惠远16塔城地区裕民县国营牧场7昌吉地区木垒县东城镇17克州阿图什市8塔城地区裕民县哈拉布拉乡18和田地区和田皮山县9塔城地区额敏县166团19伊犁地区芦草沟县10伊犁地区察布查尔县堆齐牛录乡20喀什地区岳普湖县铁热木乡1.2 供试品溶液的制备20批红花样品粉碎，过75 μm筛，室温下称取1.000 0 g红花粉末于微波超声波合成萃取仪的三口瓶中，加15 mL 50%甲醇溶液，微波功率600 W，温度70 ℃，萃取20 min. 冷却至室温，将反应液及残余的红花全部倒入25 mL容量瓶，50%甲醇定容，过0.22 μm滤膜，待测.1.3 色谱条件色谱柱：Thermo Hypersil Gold C18，(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；流速:0.3 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：270 nm；进样量：2 μL；梯度洗脱程序为：0～2 min，98% A；2～20 min，98～92% A；20～48 min，92～88% A；48～60 min，88～84% A；60～105 min，84～81% A；105～110 min，81～70% A；110～115 min，70～65% A；115～120 min，65～60% A；120～122 min，60～98% A；122～125 min，98% A.1.4 质谱条件鞘气流速：45 arb，辅助气流速：15 arb，雾化电压：3.3 KV，离子传输管温度：350 ℃，辅助气加热温度：400 ℃.2 结果与讨论2.1 色谱条件的优化2.1.1 检测波长的选择对270、403、390、367 nm 4个检测波长进行考察，不同检测波长下红花样品的出峰情况存在显著差异(如图1所示). 由图1可见，当检测波长为270 nm时，红花样品中指标成分响应最为明显，出峰个数多且峰型较好，能够提供的有效成分信息较为丰富，故选择270 nm为检测波长.图1 不同检测波长下的红花样品UPLC色谱图Fig. 1 UPLC chromatograms of safflower samples at different detection wavelengths(a) 270 nm, (b) 403 nm, (c) 390 nm, (d) 367 nm2.1.2 梯度洗脱条件的优化参考相关文献[13]，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈为流动相，并对梯度洗脱条件进行优化，最终确认1.3项下为较优色谱条件. 该条件下，红花各组分达到最佳分离，对应样品UPLC色谱图如图2所示.2.2 提取条件的优化2.2.1 提取溶剂的考察分别以甲醇∶水为0∶100(体积比)、甲醇∶水为25∶75(体积比)、甲醇∶水为50∶50(体积比)、甲醇∶水为75∶25(体积比)、甲醇∶水为100∶0 (体积比)作提取溶剂. 结果表明，提取溶剂中无甲醇或甲醇浓度过低时，红花药材中许多脂溶性组分没有出峰或者峰面积较小. 而甲醇浓度过高时，又会导致红花中的水溶性组分无法被提取出来. 故选择甲醇∶水为50∶50(体积比)作为提取溶剂.图2 红花样品UPLC色谱图Fig. 2 UPLC chromatogram of safflower sample 2.2.2 提取方法考察分别以超声辅助提取法、微波辅助提取法、基质固相分散萃取法(MSPD法)、快速溶剂提取法对红花样品进行提取，比较5种指标成分的峰面积、提取时间等(如表2所列). 由表2可见，超声辅助提取法、微波辅助提取法提取出的有效成分峰面积较大，但微波辅助提取法的提取时间仅为20 min. 故选择微波辅助提取红花样品. 表2 不同样品前处理方法所得指标成分峰面积比较Table 2 Comparison of peak area of different sample pretreatment methods方法峰面积羟A6-羟基山奈酚-3,6-二-β-d-葡萄糖苷芦丁红花黄色素A脱水红花黄色素B超声辅助提取法2159 549429 569126 388395 800688 695微波辅助提取法2 119 554453 454123 562435 329686 602MSPD法2 117 757405 612111 652362 574682 241快速溶剂提取法533 207108 94032 499111 004182 3472.3 指纹图谱的建立在上述最优条件下，对20个产地的红花样品进行分离分析. 将色谱图导入中药指纹图谱相似度评价(2004A)软件，经过设置参照谱图、系统自动匹配、生成对照谱图、相似度评价4个步骤，即得到对照指纹图谱(采用中位数法，时间窗为1.00)，其中R谱即为红花药材的UPLC对照指纹图谱(如图3所示).2.4 相似度评价相似度评价结果由2.3中的“相似度评价”步骤得出，将R谱与20张红花样品的UPLC色谱图进行比较(如表3所列). 由表3可见，除样品S1和S12与R谱的相似度低于0.70之外，其余样品与R谱的相似度均大于0.70，其中S7、S10、S11、S18与R谱的相似度均介于0.70～0.80之间，但是其相互之间的相似度都在0.80以上. 总体来看，20个样品与R谱的相似度在0.90以上.图3 20批红花药材UPLC图谱(R为对照指纹图谱)Fig. 3 UPLC chromatograms of 20 batches of safflowers (R as the control fingerprint)表3 20批红花UPLC色谱图与指纹图谱R相似度评价表Table 3 Evaluation table of similarity degree of 20 batches of safflower UPLC chromatograms and fingerprint spectra RNo.S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S20RS110.69 90.5250.6390.7260.7250.7150.5260.8750.6880.9070.6530.7080.6590.4490.8 860.7180.6390.4950.580.695S20.69910.7360.9380.9520.9390.6940.7930.809 0.6710.8210.5920.9440.9630.740.8130.960.6430.7720.7840.952S30.5250.73 610.6540.7460.7810.6740.9630.6570.7090.5820.870.750.7320.950.6550.766 0.8520.9620.9490.821S40.6390.9380.65410.9190.8930.60.7290.7680.5650.7 830.5160.9150.940.720.7360.9120.5940.7150.6840.886S50.7260.9520.7460. 91910.9360.740.7980.8260.6910.8180.6530.930.9710.7530.8190.9840.7160. 7830.8130.95S60.7250.9390.7810.8930.93610.80.820.870.7630.8270.6950.9 490.9270.7960.8720.9490.730.7810.8190.968S70.7150.6940.6740.60.740.81 0.690.830.9560.7730.7630.7340.670.6460.8460.7580.7820.6550.7260.791S8 0.5260.7930.9630.7290.7980.820.6910.680.710.6150.8060.810.7790.9660.6660.8310.8450.9660.9370.879S90.8750.8090.6570.7680.8260.870.830.6810.8 210.9440.7360.8420.7650.6230.980.8320.7840.6610.6850.841S100.6880.671 0.7090.5650.6910.7630.9560.710.82110.7330.7580.7060.6180.6640.8360.70 50.7770.6950.7180.771S110.9070.8210.5820.7830.8180.8270.7730.6150.944 0.73310.6770.8310.7630.540.9530.8190.6930.5780.6390.796S120.6530.5920 .870.5160.6530.6950.7630.8060.7360.7580.67710.6610.5940.8080.7410.657 0.9460.8090.880.687S130.7080.9440.750.9150.930.9490.7340.810.8420.706 0.8310.66110.9310.7770.830.9420.6930.7760.8180.951S140.6590.9630.7320 .940.9710.9270.670.7790.7650.6180.7630.5940.93110.7470.7590.9620.6450. 7540.7850.932S150.4490.740.950.720.7530.7960.6460.9660.6230.6640.540. 8080.7770.74710.6040.770.8390.9530.9160.83S160.8860.8130.6550.7360.81 90.8720.8460.6660.980.8360.9530.7410.830.7590.60410.8210.7620.6330.69 0.835S170.7180.960.7660.9120.9840.9490.7580.8310.8320.7050.8190.6570. 9420.9620.770.82110.7240.8020.8340.971S180.6390.6430.8520.5940.7160.7 30.7820.8450.7840.7770.6930.9460.6930.6450.8390.7620.72410.840.8620.7 41S190.4950.7720.9620.7150.7830.7810.6550.9660.6610.6950.5780.8090.77 60.7540.9530.6330.8020.8410.9360.852S200.580.7840.9490.6840.8130.8190 .7260.9370.6850.7180.6390.880.8180.7850.9160.690.8340.8620.93610.862R 0.6950.9520.8210.8860.950.9680.7910.8790.8410.7710.7960.6870.9510.932 0.830.8350.9710.7410.8520.86212.5 色谱峰的指认采用UPLC-MS对红花样品进行检测，对已达到分离要求的组分进行质谱分析. 将各组分的分子量与文献中已报道的组分进行比较，确认红花中11个未知组分(如图4所示). 20批红花的11个共有峰的保留时间及峰面积如表4、5所列.根据高分辨质谱提供的准确分子量与红花中已知组分的分子量进行对比，将理论分子量和实测分子量进行比较计算，对于质量偏差小于2 ppm的组分予以确认，共确定了11个组分，按照保留时间的先后顺序分别如表6所列.图4 UPLC-MS联机分析红花药材中的11个组分Fig. 4 Analysis of 11 components in safflower by UPLC-MS表4 20批红花样品11个共有峰的保留时间Table 4 Retention times of 11 peaks in 20 batches of safflower samples编号保留时间/minS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S20RSD/%1 2.762.682.692.782.722.672.672.692.702.692.772.702.702.702.702.692.702.70 2.702.690.84216.8716.7816.8016.8916.7816.7216.7916.7716.8316.8116.971 6.8816.7416.8116.8016.8016.7316.8416.8016.770.24318.0618.0818.1218.15 18.1218.1218.0818.1218.1418.0918.1118.0918.0918.0918.0918.1018.1118.1 418.1218.110.13418.8218.8518.8918.9118.8818.8918.8618.8918.9118.8618. 8718.8618.8618.8618.8618.8618.8818.9018.8918.870.12531.3831.4831.5731 .6331.6231.5631.5431.5831.6131.5731.4831.5231.5631.5631.5831.5831.603 1.6231.5831.580.18632.1932.3132.4032.4732.4532.4032.3832.4132.4432.39 32.3132.3532.3932.3932.4132.4232.4432.4532.4132.410.19735.3835.4835.5 735.6635.6335.6035.5835.5935.6235.5835.4935.5235.5535.5635.5835.6035. 6135.6235.5835.580.21836.2636.3536.4436.5336.5136.4936.5036.4736.5036 .5036.3736.4036.4336.4436.4736.5036.5236.5036.4736.460.31941.1641.244 1.4041.4441.4341.4741.3841.4041.4341.4241.2841.3341.3541.3941.4341.40 41.4541.4341.3841.400.191051.5751.7251.8651.8851.9151.8951.8851.8951. 9051.8651.7451.8551.8651.8751.8651.8651.9051.8951.8851.880.131157.4757.6057.7057.7057.6957.6757.7257.7357.7257.7457.6557.7157.6857.7357.69 57.7257.7357.7357.7357.710.17表5 20批红花样品11个共有峰的峰面积Table 5 Peak areas of 11 peaks in 20 batches of safflower samples编号峰面积S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S201105 684246 926137 075115 490133 850198 284243 385171 37986 964288 488247 474123 258149 368116 106167 312225 76967 173225 769176 267251 08021 454 8821 044 9851 164 5241 828 0472 190 3752 759 0951 800 7602 248 2161 787 4031 586 1491 607 9641 427 6742 400 0661 963 5351 943 1072 097 4132 675 2161 855 2182 143 8932 277 7883191 917310 145208 483316 900303 887351 784535 262275 297241 216395 360249 980197 784348 395290 844268 256303 890340 396231 961295 652340 6994125 406185 239139 213197 392175 178186 137334 794187 067132 219222 704175 980178 027190 190186 408171 653195 209194 087156 466185 324177 4025283 920531 671400 534570 472513 718747 8641 068 029533 316394 087557 294479 337485 595650 309511 944551 968422 219723 047397 314414 325517 8256159 878320 248262 289229 087282 090465 482259 247340 615229 951139 053329 138229 229389 615315 082379 099289 880318 607232 790226 703310 9727176 332254 205253 849318 953297 091379 166295 201373 583253 072353 427174 740237 598411 369310 318298 918223 900356 595252 964343 432289 0818112 852181 107199 257190 203181 818245 33383 510232 481143 04467 138139 989126 550231 059186 676192 512145 721159 987153 249167 642162 383975 41688 45165 54678 08867 50257 14592 57078 14043 76310441077 94174 21189 29795 04278 857110 13374 259115 53157 65669 2441030 07240 72128 704395 739364 427366 372399 794450 970287 997314 284351 049347 073300 723407 212287 044395 739364 427366 372399 794450 97011386 129677 642581 951754 895790 5011 073 503749 579661 408540 857645 617343 884587 950975 196715 801806 528636 296877 197602 264729 990830 130表6 红花药材中11个共有峰具体信息表Table 6 Specific information table of 11 common peaks in safflower编号中文名分子式保留时间/min[M+H]-(实测值)[M+H]-(理论值)质量偏差/ppm1异槲皮苷同分异构体C21H20O122.78463.088 87463.088 201.452羟基红花黄色素A[14]C27H32O1616.81611.162 17611.161 760.6736-羟基山奈酚-3,6-二-O-β-D-葡萄糖苷-7-O-β-D-葡萄糖醛酸[15 ]C33H38O2318.11801.174 50801.173 111.7346-羟基山奈酚-3,6-7-三-O-β- D-葡萄糖苷[15]C33H40O2220.79787.195 07787.193 851.5556-羟基山奈酚-3,6-二-O-β-D-葡萄糖苷[15]C27H30O1731.51625.141 11625.141 020.1466-羟基山奈酚-3-0-β-D-芸香糖苷-6-0-β-D-葡萄糖苷[15]C33H40O2132.37771.199 65771.198 930.937异槲皮苷同分异构体C21H20O1235.57463.088 87463.088 201.458芦丁同分异构体C27H30O1636.43609.146 73609.146 111.029芦丁[16]C27H30O1641.34609.146 61609.146 110.8210红花黄色素A[17]C27H30O1551.78593.151 61593.151 190.7111脱水红花黄色素B[18]C48H52O2657.601043.267 821043.267 400.403 结论本研究以来自新疆伊犁地区、塔城地区、昌吉地区、喀什地区及和田地区等不同产地的20批红花样品为分析对象，建立了一种UPLC-MS指纹图谱分析方法，确定了67个共有峰，并通过UPLC-MS指认了其中的11种组分. 本文建立的UPLC-MS指纹图谱可识别出更多的有效成分，在红花药材的质量评价方面更具优势，可为红花药材质量的全面控制提供一定的借鉴. 同时，该方法可为构建红花药材质量分析体系与优质红花药材种质的筛选奠定基础，为红花药材的质量分析与评价提供较为全面的技术支撑和参考.参考文献:【相关文献】[1] FAN L J, GUO Meili. 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