最新2分子克隆

BamH Ⅰ
GGATCC CCTAGG
(4)酶靶顺序大小是很重要的，它决定产生特定DNA中段的大小。
若DNA碱基组成是均一的，限制酶切点是随机的，那么对于： ① 要求4bp靶序列如HpaⅡ,MboⅠ等在庞大DNA链上平均44核苷 酸即可遇到一个靶序列，即1/256 ② 同理，要求6bp的酶，则平均46遇到一个靶序列，即1/4096。
核酸内切酶。
BamHⅠ G GATC C BclⅠ T GATC A
C CTAG G
A CTAG T
二．DNA连接酶
1. DNA连接酶： 大肠杆菌染色体编码 粘末端连接 NAD+供能
2. T4 DNA连接酶：大肠杆菌T4噬菌体DNA编码 粘末端、平末端连接 已知唯一平末端连接酶 ATP供能
DNA 连 接 酶 是 基 因 工 程 重 要 的 工 具 酶 ， 常 用 T4DNA ligase. （一）功能：催化有互补顺序的两个DNA分子的粘性末 端或平头末端3’－OH、5’－P连接作用。 （二）来源－噬菌体T4感染E coli分离的一种单链多肽酶、 MW.68KD。 （三）催化反应：
一、限制性内切酶
定义：特异性识别双链DNA并进行切割的酶。 内切：在DNA内部切割 限制性：识别特异位点切割
------GAATTC-----------CTTAAG------
EcoRⅠ酶切位点
命名（1973年Smith 原则、Ⅱ型酶）
根据分离此酶微生物的学名，一般取3个字母。 第一个字母大写 该微生物属名前的第一个字母 第二、三个字母小写 该微生物种名前的2个字母 第四个字母大写 有变种或品系的第一个字母 罗马字母Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 从一种微生物中发现了几种不同特异性限
如：EcoR Ⅰ（*）
Ⅱ型限制酶切口特点
如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端；
5′－G↓AATT C－3′ 5′－G-OH
p-AATTC－3′
3′－C TTAA↑G－5′ 3′－CTTAA
G－5′
PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端：
5′－C TGCA↓G－3′ 5′－CTGCA-OH p-G－3′
制酶，按发现顺序排列
如EcoRⅠ是指从大肠杆菌（Escherichia coli） R 株分离得到的第一种限制酶。
命名
酶的来源
酶的名称
Haemophilus influenzae d
ห้องสมุดไป่ตู้属名
种名 株系
Hind Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
分类
Ⅰ
DNA底物 双链DNA
辅因子
Mg2+ ATP SAM
识别序列 特异
切割位点 非特定
2.一个位点包含在另一个位点之中 HpaⅡ CC↓GG SmaⅠ CCC↓GGG SmaⅠ的6个bp
含HpaⅡ的4个bp顺序，所以HpaⅡ 能识别与切割 SmaⅠ的6个bp，但含有HpaⅡ的ccgg的其它6核苷酸 顺序不能被SmaⅠ切割。 3．同尾酶
指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的
The Double Helix (1953) The foundation of molecular biology
Francis H. Crick James D. Watson
中 心 法 则
二、基因克隆的特点和技术路线
技术路线：
1 分离制备目的DNA片段和载体 2 目的DNA与载体的剪切 3 目的DNA与载体的连接 4 重组DNA分子转化宿主细胞 5 筛选阳性克隆，大量扩增
特点
Ⅱ型限制酶： 识别4-6个核苷酸 识别的核苷酸具有回文结构 可以形成平末端、粘末端 切口概率 星号活力
星号活力定义：
限制酶在非标准反应条件下，能够切割一些与其 特异识别的序列类似的序列的现象。
影响因素：甘油浓度过高，低离子强度，限制酶用量过大，
高PH，有机溶剂污染
表示方法：在相应的酶上加星号表示。
识别序列前后
100-1000bp
修饰作用 有
Ⅱ
双链DNA
Mg2+
特异 特定
之中
无
Ⅲ
双链DNA
Mg2+ ATP
特异 特定
之后25bp~27bp
有
限制酶的识别位点
一般特征（4点）：
（1）Ⅱ型酶识别的特殊DNA序列称为限制酶的识别位点（或切 割位点）。
（2）它能识别DNA的4－6bp的回文序列并水解该部分的核苷键。 一般来说是4－6bp，有6个以上的，但没有4个以下的。 （3）识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。如：
MboⅠ和 SauSⅠ（ －NN↓GATCNN-3′） -NNCTAG↓NN-5′
(2)识别顺序同，切割位点不同，如：
SmaⅠ CCC↓GGG 和 XmaⅠ C↓CCGGG
(3)识别与切割相同，但其中一酶可以切“修饰” （甲基化*），另一酶不能。如：
HpaⅡ→CCGG 和 MspⅠ→CCG*G
MboⅠ→GATC 和 Sau 3A →GA*TC
2分子克隆
本章，我们讨论4个问题： 1. 什么是DNA克隆技术——DNA克隆技术的概念。 2. 为什么能进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的原理
和技术路线。 3.怎样进行DNA克隆技术——DNA克隆技术的步骤
（DNA体外重组，重组DNA导入宿主细胞后扩增和表 达，基因工程后处理） 4. DNA克隆技术的应用和前景——对于医学来说即生产 基因工程产品、开展基因治疗等。
3′－G↑ACGT C－5′ 3′－G
ACGTC－5′
还有一些酶沿对称轴切割DNA，产生平端或钝端（blunt end） 如SmaI:
5′－CCC↓GGG－3′ 5′－CCC
GGG－3′
3′－GGG↑CCC－5′ 3′－GGG
CCC－5′
几种特殊的内切酶
1．异源同工酶（Isoschizomers）也称同裂酶:来源 不同，识别顺序相同，切割方式可同可不同： (1)识别顺序与切割方式同，如：
特点：分子水平操作，细胞水平表达
基本原理
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 外源基因与载体的连接
DNA导入受体菌 重组体的筛选 克隆基因的表达
第二节 工具酶
常用的工具酶（tool enzymes）有：
1.限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease) 2.DNA连接酶（DNA ligase,ligase) 3.逆转录酶(reverse transcriptase) 4.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA pol) 5.核酸酶(nuclease) 6.末端转移酶(terminal transferase) 7.碱性磷酸酶(BAP或CIP) 以1. 和2. 最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。