2酵母蔗糖酶

酵母蔗糖酶固定化及应用酵母蔗糖酶是一种重要的酶类，在生物技术、制药和食品加工行业中有着广泛的应用。

对于酵母蔗糖酶的固定化技术，近年来研究逐渐深入。

基于此，本文将探讨酵母蔗糖酶固定化的相关技术及其应用。

一、酵母蔗糖酶的固定化技术1. 常用的固定化技术酵母蔗糖酶的固定化技术主要包括物理吸附、共价键结、包埋化、交联和细胞包埋等方法。

其中，物理吸附、共价键结和包埋化方法操作简单，但稳定性较差。

而交联和细胞包埋方法稳定性较高，但操作繁琐、耗时长。

2. 固定化载体的选择对于酵母蔗糖酶固定化，选择合适的载体是十分重要的。

固定化载体应具有良好的生物相容性、化学稳定性、机械强度和比表面积，以保证固定化酶的稳定性和活性。

目前，常用的载体有聚丙烯酰胺凝胶、海藻酸钙凝胶、硅胶、磁性微粒子、生物纤维素、玻璃等。

3. 固定化条件的优化在固定化过程中，对于固定化条件的优化也是非常重要的。

其中，主要包括pH 值、温度、离子强度、连接剂种类和浓度等因素。

通过优化固定化条件，可以提高固定化酶的稳定性和活性，延长固定化酶的使用寿命。

二、酵母蔗糖酶固定化的应用1. 工业生产酵母蔗糖酶固定化技术在工业上的应用非常广泛，主要包括分离和纯化制药物、糖类及氨基酸、制备高级糖类、酯化反应和生物制剂中。

此外，酵母蔗糖酶固定化还可以用于生产检测试剂、医用葡萄糖监测仪、食品生产和货币伪造检测等。

2. 生物技术酵母蔗糖酶固定化在生物技术中的应用主要包括预测抗体、分子诊断、生物传感器和草药分析等方面。

在生物传感器中，酵母蔗糖酶固定化可以用于制备特定的实验室设备，如生物传感器的工作电极、荧光记忆基质、假人胶、化学传感器等。

三、总结酵母蔗糖酶固定化技术应用非常广泛，因此具有非常重要的意义。

本文简要介绍了酵母蔗糖酶固定化技术的相关内容和应用。

随着科技的不断进步，这种固定化技术在未来将有更广阔的发展前景。

酵母蔗糖酶的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习酵母蔗糖酶的提取方法，并掌握其酶活力的测定方法。

二、实验原理酵母蔗糖酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品工业、医药工业等领域。

其提取方法主要包括细胞破碎法和超声波法。

细胞破碎法是将酵母细胞经过离心、洗涤后，在低温下使用高压均质机或超声波仪器进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。

而超声波法则是将细胞悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。

三、实验步骤1. 酵母菌体培养：将活性酵母菌体接种到含有10%蔗糖和0.5%酵母粉的液体培养基中，在30℃下静置48小时。

2. 细胞破碎：将培养好的菌体通过离心后洗涤两次，然后在低温下使用高压均质机进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。

3. 超声波处理：将菌体悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。

4. 酶活力测定：取一定量的提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，在37℃下反应30分钟后用硫酸铜试剂测定还原糖的含量。

四、实验结果通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，测得其酶活力分别为10.5 U/g和12.8 U/g。

五、实验分析1. 细胞破碎法和超声波法都可以用于酵母蔗糖酶的提取，但是超声波法更加快速、高效。

2. 酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意培养基成分和温度等因素。

3. 酵母蔗糖酶的测定方法可以采用硫酸铜法，但是也可以采用其他方法，如比色法和光度法等。

六、实验结论本实验通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，并测定了其酶活力。

结果表明，超声波法更加高效。

同时，酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意调整培养条件。

最后，硫酸铜法可以用于测定酵母蔗糖酶的活力。

一、背景介绍酵母蔗糖酶是一种重要的酶类，它在葡萄糖代谢途径中起着关键作用。

酵母蔗糖酶的提取纯化及酶活测定是生物化学与分子生物学研究中常见的实验操作。

在这个过程中，酵母蔗糖酶的纯化程度和酶活测定的准确性直接影响着后续的实验结果。

二、传统提取纯化及酶活测定方法存在的问题1. 低纯度：传统的提取纯化方法往往不能够完全去除其他蛋白质或杂质，导致提取的酵母蔗糖酶纯度较低。

2. 酶活测定不精准：常见的酶活测定方法对于活性较低的酶样本测定效果较差，难以得到准确的酶活性数据。

3. 操作繁琐：传统方法需要多次离心、沉淀和洗涤等步骤，耗时且操作繁琐。

三、改进方法鉴于传统方法存在的问题，我们提出了一种改进的酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定方法，主要包括以下几个关键步骤：1. 酵母蔗糖酶提取（1）酵母细胞破碎：采用超声波破碎或高压破碎技术，将酵母细胞有效破碎，释放出蔗糖酶。

（2）蛋白质沉淀：利用差速离心法或特定沉淀剂沉淀出目标蛋白质，提高酶的纯度。

2. 酶活测定（1）比色法测定：采用改良的Folin-Phenol比色法，提高对酶活性的测定准确性。

（2）酶活性计算：采用新的酶活性计算公式，更准确地反映酶的活性水平。

四、结果与讨论我们采用改进方法对酵母蔗糖酶进行提取纯化及酶活测定，得到的结果表明，与传统方法相比，改进方法在以下几个方面有了显著改善：1. 提取纯化效果显著：采用改进方法提取的酵母蔗糖酶纯度明显提高，杂质含量大幅降低。

2. 酶活测定更准确：采用改进方法测定的酶活性数据更为准确可靠，对活性较低的酶样本也能够进行精准测定。

3. 操作简便高效：改进方法简化了提取纯化的操作步骤，减少了操作时间，提高了实验效率。

五、结论我们的改进方法在酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定中取得了良好的效果，显著提高了酶的纯度和活性测定的准确性，为相关领域的研究提供了重要的实验技术支持。

该方法的推广应用将有助于推动相关研究领域的发展，促进酵母蔗糖酶的深入研究和应用。

蔗糖酶的发酵生产及酶学性质研究摘要：本实验酵母中蔗糖酶进行分离纯化并对酶学性质进行了初步的研究。

结果表明:酵母蔗糖酶的最适pH为5.0, 最适温度为45℃。

关键词：蔗糖酶、酶学性质1前言蔗糖酶(Sucrase, EC3.2.1.26) 又称转化酶(Invertase)。

可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。

由于果糖甜度高,可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。

本实验对酶的动力学性质分析, 是酶学研究的重要方面。

本研究通过一系列实验对酵母蔗糖酶的动力学性质如最适温度、最适pH、酶的固定化等进行了初步研究，更好的了解了没得性质。

2材料与方法2.1 材料与设备2.1.1 实验材料酵母、活性干酵母、壳聚糖2.1.2 试剂及配制方法葡萄糖、蔗糖、豆芽汁浸汁、Na2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、NaOH、Na2CO3、盐酸、氨水、琼脂、酒精均为国产分析纯。

95%乙醇溶液、DEAE-Sepharose Fast Flow、1 mol/L醋酸溶液、0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内含0.5 mol/L NaCl溶液，pH值7.3)葡萄糖标准液配制（1mg/ml）：预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。

准确称取500mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至500ml容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。

1% 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂：酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。

冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。

10%蔗糖溶液：10g蔗糖溶解于蒸馏水中，定容至100ml0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液1%戊二醛溶液：将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL 0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液：称取16.4g无水乙酸钠，溶解于800ml蒸馏水，用冰乙酸调节其ph至4.5，然后定溶至1000mL。

酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。

通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。

本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。

2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。

b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。

步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。

b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。

c) 用低速离心将沉淀分离。

收集上清液备用。

步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。

b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。

c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。

d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。

e) 计算酵母蔗糖酶的活性。

3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。

根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。

这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。

通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。

我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。

通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。

总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。

酵母蔗糖酶的提取方法酵母蔗糖酶是重要的糖分解酶，它可以被用来制造蔗糖、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物。

因此，它在化工、食品、制药行业中有着重要的应用价值。

本文介绍了从发酵酵母或发酵液中提取酵母蔗糖酶的方法。

一、原料准备首先，准备发酵酵母或发酵液。

发酵酵母可以使用乳酸乳杆菌培养基发酵培养，得到的酵母菌可以悬浮在一定的温度和 pH 下曝气发酵，以获得最大的效果。

发酵液可以采用蔗糖和氨基酸等制备，并需要调节合适的 pH温度，可以提高酶的活性。

二、提取酵母蔗糖酶1.发酵酵母或发酵液放入滤器，用中压过滤来滤出悬浮体；2.过滤得到的酵母蔗糖酶悬浮液中加入NaCl，来降低活性；3.溶液中的毛细管类蛋白分离出来，加入45%的乙醇萃取分离；4.溶液冷冻至冰点，冻干抽滤以获得纯化的蔗糖酶；5. 从冻干抽滤物中继续利用膜精制器以及离子交换柱等方式，将蔗糖酶高纯度分离出来；6.高纯度蔗糖酶经过适当稀释处理，可获得最终产品。

三、性能测试为了判定提取的酵母蔗糖酶的性能，需要进行一系列的性能测试，这些测试可以用来检测酶的活性、热稳定性、抗菌性以及稳定性等。

通过这些测试，可以确定提取的酵母蔗糖酶的性能，从而确保它能够满足采用的要求。

四、应用实践酵母蔗糖酶的提取方法在实际应用中几乎是必不可少的，它可以用来生产糖浆、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物等，常用于食品加工、精细化工、制药行业等。

此外，这种提取方法还可以应用于糖类合成、氨基酸修饰等方面，发挥着重要的作用。

综上所述，酵母蔗糖酶是一种重要的糖分解酶，用于生产糖类衍生物，它的提取方法包括发酵酵母或发酵液的原料准备、提取、性能测试以及应用实践等，是一项重要的工作。

只有抓住机会，把提取的酵母蔗糖酶用好，才能实现糖分解酶的高效利用。

第1篇一、实验目的1. 理解蔗糖酶的催化原理和特性。

2. 掌握蔗糖酶的提取、纯化方法。

3. 学习通过不同方法测定蔗糖酶的活力。

4. 分析影响蔗糖酶活性的因素。

二、实验原理蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。

本实验旨在通过提取、纯化蔗糖酶，并测定其活力，了解蔗糖酶的特性。

三、实验材料与试剂1. 材料：- 酵母细胞- 淀粉- 蔗糖- 还原糖试剂（如班氏试剂）2. 试剂：- 磷酸氢二钠溶液- 磷酸二氢钠溶液- 硫酸铵溶液- 硫酸铜溶液- 酒精- 氢氧化钠溶液- 丙酮- 酶提取缓冲液1. 蔗糖酶的提取：- 将酵母细胞用磷酸缓冲液洗涤，并悬浮于磷酸缓冲液中。

- 使用匀浆机破碎细胞，收集匀浆液。

- 将匀浆液离心，收集上清液即为蔗糖酶粗提液。

2. 蔗糖酶的纯化：- 将蔗糖酶粗提液用硫酸铵溶液进行盐析，收集沉淀。

- 将沉淀用磷酸缓冲液溶解，并使用凝胶过滤柱进行纯化。

3. 蔗糖酶活力的测定：- 将纯化后的蔗糖酶与蔗糖溶液混合，在适宜的温度下反应。

- 加入还原糖试剂，观察颜色变化，根据颜色变化判断蔗糖酶的活力。

五、实验结果与分析1. 蔗糖酶的提取：- 通过匀浆和离心，成功提取出酵母细胞中的蔗糖酶。

2. 蔗糖酶的纯化：- 通过盐析和凝胶过滤柱，成功纯化出蔗糖酶。

3. 蔗糖酶活力的测定：- 在适宜的温度下，蔗糖酶能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖。

- 加入还原糖试剂后，溶液颜色发生变化，表明蔗糖酶具有活力。

4. 影响蔗糖酶活性的因素：- 温度：在一定范围内，温度升高，蔗糖酶的活力增加。

- pH值：在一定范围内，pH值升高，蔗糖酶的活力增加。

- 抑制剂：某些物质（如重金属离子）可以抑制蔗糖酶的活力。

1. 本实验成功提取和纯化了蔗糖酶，并测定了其活力。

2. 实验结果表明，温度和pH值是影响蔗糖酶活性的重要因素。

3. 在实际应用中，需要根据具体情况进行酶活性的调控，以获得最佳催化效果。

七、实验结论1. 蔗糖酶是一种能够将蔗糖分解为葡萄糖和果糖的酶。

一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。

2. 掌握酶活力测定的原理和方法。

3. 了解酶的专一性及其影响因素。

二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。

本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶，并在一定条件下测定其活力，以了解其催化活性。

三、实验材料与仪器材料：1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器：1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。

- 将匀浆转移至离心管中，离心分离，收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。

2. 酶活力测定- 取适量提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，置于恒温水浴锅中保温。

- 定时取样，用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。

- 根据还原糖含量计算酶活力。

3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应，观察酶的催化活性。

- 对比实验结果，分析酶的专一性。

4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定，观察pH对酶活力的影响。

- 分别在不同温度下进行酶活力测定，观察温度对酶活力的影响。

五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下，酶活力最高，约为0.5单位/毫升。

2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用，而对淀粉无催化活性。

3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。

在pH 6.8、37℃条件下，酶活力最高；在酸性或碱性条件下，酶活力明显降低；在低温条件下，酶活力较低。

六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶，并测定了其活力。

2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用，对蔗糖具有高效催化活性。

3. 酶活力受pH和温度的影响较大，适宜的pH和温度有利于提高酶活力。

七、实验讨论1. 本实验中，酶活力的测定方法较为简单，但结果准确可靠。

酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。

酵母蔗糖酶分子量约270000D，pI约5．0，最适pH4．6，耐酸和热，50℃保温30min 仍具有相当的活力，最适温度37℃。

耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。

二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。

加热纯化。

乙醇分级沉淀。

纤维素柱层析分离纯化。

㈠、前三步分离纯化的原理如下：甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等取中层50水浴中使热不稳定蛋白变性上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等㈡、纤维素柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。

离子交换层析是一种液-固相层析技术。

其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。

在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素、强碱型的离子交换树脂等。

反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。

离子与交换剂的静电结合作用具如下特点：选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。

遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它）离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。

1. 掌握从酵母中提取蔗糖酶的基本方法。

2. 了解酶的提取、纯化及活力测定的原理和操作。

3. 掌握酶活性测定的方法。

二、实验原理蔗糖酶（Invertase）是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。

本实验采用酵母作为原料，通过破碎细胞、离心、沉淀、透析等步骤提取蔗糖酶，并对其进行活力测定。

三、实验材料与仪器材料：1. 酵母（安琪酵母粉）2. 蔗糖3. 葡萄糖4. 果糖5. 磷酸盐缓冲液（pH6.0）6. 3，5-二硝基水杨酸（DNS）仪器：1. 电子天平2. 离心机3. 恒温水浴锅4. 分光光度计5. 试管6. 烧杯7. 移液器1. 酵母细胞的制备：- 称取1g酵母粉，加入10ml磷酸盐缓冲液（pH 6.0），搅拌均匀，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。

- 将保温后的酵母悬液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。

2. 酶液的提取：- 向上清液中加入等体积的50%饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀，置于4℃冰箱中过夜。

- 将沉淀物以3000r/min离心10分钟，收集上清液即为粗酶液。

3. 酶液的透析：- 将粗酶液置于透析袋中，置于磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中透析过夜，以去除硫酸铵等小分子杂质。

4. 酶液的活力测定：- 取1ml蔗糖溶液（2%蔗糖溶液），加入1ml透析后的酶液，置于37℃恒温水浴锅中保温30分钟。

- 取0.5ml反应液，加入2ml DNS试剂，沸水浴5分钟。

- 取出后，加入4ml蒸馏水，在540nm波长下测定吸光度。

五、实验结果与分析1. 酶液活力测定结果：- 通过DNS试剂显色，根据吸光度计算出酶的活力。

2. 结果分析：- 通过对比不同处理条件下的酶活力，分析提取、纯化过程中酶活力的影响因素。

六、实验结论1. 通过本实验，成功从酵母中提取了蔗糖酶。

2. 酶的提取、纯化过程中，酶活力受到pH、温度、离子强度等因素的影响。

3. 透析法是一种有效的酶纯化方法，可以去除小分子杂质，提高酶的纯度。

酵母蔗糖酶的制备原理
一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介
蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。

酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。

耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。

二、酵母蔗糖酶的分离纯化
本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，离子交换柱层析分离纯化。

前三步分离纯化的原理如下：
甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质
酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等
研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等
取中层50℃水浴中上清：蔗糖酶、可溶性糖等
（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白
取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等
冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等
三、蔗糖酶活力的测定原理
蔗糖酶
蔗糖葡萄糖+ 果糖(G和F都具半缩醛羟基，该半缩醛羟基可被pH4.5~5.5 氧化为羧基，这样的糖称还原糖)
OH -
还原糖+ 3，5-二硝基水杨酸糖酸+ 3-氨基-5-硝基水杨酸
△（棕红色，540nm处具特征光吸收，OD值与
还原糖含量成正比，可据此进行比色测定）蔗糖酶活力单位定义：一定条件下（50℃，pH4.6），一分钟内能产生1mg 还原糖的酶量。

有不舒服记得找医生，千万不要小不舒服酿成大问题。

实验2 酵母蔗糖酶的制备一、实验目的1、了解蔗糖酶的特异性催化特征2、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶二、实验原理蔗糖酶催化蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的一种酶，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。

不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。

啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。

三、实验器材1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、95％乙醇1mol/L乙酸2、材料：啤酒酵母3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。

四、实验步骤1 研磨水提取(1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。

(2)称取5g湿啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。

(3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。

(4) 将混合物转入离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。

(5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。

(6) 将上清液转入量筒，量出体积。

用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。

（7）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。

2 热处理和乙醇沉淀(1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。

(2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。

(3)将上清液转入离心管中，放人冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐)，缓慢地加入等体积预冷至—20℃的95％乙醇，同时轻轻搅拌．再在冰盐浴中放置l0min、以沉淀完全。

蔗糖酶的测定原理
蔗糖酶（Sucrase）是一种催化蔗糖（麦芽糖）水解为葡萄糖
和果糖的酶。

测定蔗糖酶的活性常用的方法是通过测定其催化蔗糖水解生成葡萄糖的速率来间接测定。

测定蔗糖酶活性的实验步骤如下：
1. 准备反应体系。

一般采用含有蔗糖酶的提取物或纯化酶溶液作为反应体系，同时加入含有蔗糖的缓冲液。

2. 加入底物。

将一定量的蔗糖溶液加入反应体系中，使反应开始。

3. 控制反应条件。

将反应体系保持在适当的温度和pH值下进
行反应，通常蔗糖酶的最适催化温度为37°C，最适pH为6.8。

4. 反应时间控制。

反应一定时间后，停止反应。

5. 停止反应。

通常通过加入一定体积的酸性溶液来停止反应，将剩余的蔗糖转化为葡萄糖和果糖。

6. 对产生的葡萄糖进行测定。

葡萄糖的测定可以采用多种方法，如酶促发色法、底物比色法等。

通过测定蔗糖酶催化蔗糖水解生成的葡萄糖的量，可以间接测定蔗糖酶的活性。

活性通常以每分钟生成的葡萄糖的微摩尔数来表示。

需要注意的是，在文中不能再出现和标题相同的文字，以免造成重复。

酵母蔗糖酶的提取工艺摘要蔗糖酶是一种水解酶, 广泛存在于动物、植物、微生物等各种生物体内。

它可以不可逆的催化蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖，为微生物的生长提供碳源和能源。

采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶[1]，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。

其中冻融法的效率最高（纯化倍数比活力与总活力），加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。

比较了乙醇分级沉淀、硫酸铵分级沉淀对于冻融法得到的粗提物的沉淀效果，结果表明：50%(w/w)乙醇分级沉淀效果较好（比活力与总活力），乙醇分级沉淀所得蔗糖酶经DEAE-Sepharose 离子交换层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶（比活力与总活力）。

纯化倍数为16.14倍，比活性为947.805U/mg，回收率为51.6%。

蔗糖酶的酶促动力学性质表明，蔗糖酶的最适PH值为4.5，最适温度为50℃，酶的特征米氏常数Km值为13.8mmol/L，最大反应速度Vmax为5.98ug/min。

关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化Study on Purification of Invertase from YeastAbstractSucrase is widespread in prokaryotes and eukaryotes .Sucrase catalyzes the irreversible hydrolysis of sucrose into glucose and fructose.the mainfroms 实用文档of carbon and energy supplies in microorganism growth and development.This paper used three methods to extract invertase from yeast,which included in this manuscript, three different extraction method breaking cells by adding methylbenzene,frost grinding,and adding SDS for extracting invertase from yeast were investigated.Then the purified invertase was obtained by precipitatation with 50% ethyl alcohol、sequential ammonium sulpate precipitation and DEAE-Sepharose lon-exchange chromatography.The purified sucrase was characterized by SDS-PAGE.The results showed all three methods had both advantages and disadvantages.The invertase extracted by adding SDS and frost grinding had much more total activity than that of extracted by adding methylbenzene.A highest total invertase activity was found in the forst grinding,and it was a convent and economical method for commercial production of invertase from yeast.The results of our study were followed:1、Purification of invertase from yeastThe specific activity was 947.805U/mg,purification fold was 32.28.The activity recovery of sucrase was 51.6%.2、Properties of sucrase实用文档The kinetic characters of the enzyme have been studied.The optimum PH and optimum temperature for the enzyme are PH4.5 and 50℃.Km is 21mmol/Land Vmax is 6.57ug/min.Key words : yeast;invertase;extraction;purification第一部分文献综述蔗糖酶（Sucrase,EC 3.2.1.26）又称转化酶（Invertase），是将蔗糖水解成D-葡萄糖和D-果糖的ß-D-果糖苷酶的一种。

酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。

比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。

纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。

以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。

结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。

其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。

关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。

可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。

由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。

可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。

目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。

作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。

通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。

1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。

1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。

UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。

综合性实验2酵母蔗糖酶浓度及酶活力测（一）实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度，用3.5 —二硝基水杨酸法测定酶活力。

掌握各步骤的实验原理和方法。

（二）实验原理本实验采用Bradford法［10］又称考马斯亮蓝染色法（Coomassie brilliant blue staining）测定蛋白浓度，属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝有G250和R250两种。

其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用作蛋白质含量的测定。

考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在OD465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，蛋白质-色素结合物最大吸收峰改变为OD595nm其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝G250结合在2min左右的时间内达到平衡，反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法高近4倍，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度，在10~100gg/mL蛋白质浓度范围内成正比。

因此在测定各级分蛋白质含量时应稀释适当倍数，使其测定值在标准曲线的直线范围内。

本实验采用DNS法［11］测定，属于染料结合法的一种。

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中蔗糖（双糖）和淀粉（多糖）是非还原糖。

蔗糖酶能催化非还原性蔗糖的1,2-糖昔键裂解，释放出等量的D-葡萄糖和D-果糖［12］。

每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖。

还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5 —二硝基水杨酸被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸（图1）。