迁移实验
目的：检测细胞的迁移能力或药物对细胞迁移能力的影响。材料：HepG2细胞、BD公司insert、BD公司24孔板
步骤：
1.将饥饿24小时的细胞从孵箱取出，酶解好，弃酶，加入无血清培养基，吹打混匀，离心800 x 3min.
2.弃上清，细胞沉淀加入无血清培养基吹打混匀，计数，稀释浓度为2 x 105个/ml.
3.取出insert放入24孔板中。先加下室培养基（含血清1%）700微升，insert中加入200微升细胞悬液。
4.将insert放置到24孔板的相应位置，防止insert底部有气泡，否则将影响实验结果。
5.37℃孵箱4--6小时。
6.取出24孔板，弃去上下室培养基。下室加入700微升从-20保存的甲醛，4度放置1小时。
7.弃去甲醛，PBS洗一遍，下室加入苏木精700微升。染色20-30min.
8.回收苏木精。Insert 用PBS洗3遍，每次都用棉棒擦拭insert里边，将没有迁移的细胞擦去。
9.下室加入PBS700uL，将Insert放好，明视场照相（200倍）。每组每个Insert随意拍照6个视野，细胞计数取平均值。
10.细胞计数用imageJ软件。Open--分析--cell count。
Transwell实验原理与操作步骤 Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。 （2）趋化性实验： 可用5.0、8.0、12.0μm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 ①细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 ②趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。 （3）肿瘤细胞迁移实验： 常用8.0、12.0μm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。
《电迁移原理》 的思考总结与扩展 ：旭瑞 专业：华东师大学微电子 电迁移原理：
集成电路芯片部采用金属薄膜引线来传导工作电流，这种传导电流的金属薄膜称作互连引线。随着芯片集成度的提高，互连引线变得更细、更窄、更薄，因此其中的电流密度越来越大。在较高的电流密度作用下，互连引线中的金属原子将会沿着电子运动方向进行迁移，，其结果会使导体的某些部位产生空洞或晶须，这种现象就是电迁移。它是引起集成电路失效的一种重要机制。 电迁移失效机理 产生电迁移失效的 因：薄膜导体结构的非均匀性 外因：电流密度 从缺陷产生和积累得角度，我们可以这样解释电迁移的失效机理，即在电迁移过程中，在子风和应力的作用下，互连线中的某些薄弱部位产生了缺陷;缺陷的产生，重新改变了互连线中电流的分布，进而也会影响热分布;这两个过程相互作用，决定了缺陷在哪些薄弱部位产生;随着时间的增加，缺陷不断积累，相邻较近的缺陷融合成一个大缺陷;当产生的缺陷足够大，在垂直电流的方向上占有足够的面积，互连线的电阻就会显著增加;最后当形成的缺陷横跨整个互连线横截面，互连线断路在图2.4中，我们考虑金属原子A，它的周围有十二个相邻的晶格位置，其中之一被空位V占据，其余被其他金属原子占据。在无电流应力条件下，由于热运动，原子A向其附近任何一个方向移动的概率是相等的;若在“电子风”吹动的情况下，很明显原子A向电子风方向移动概率大大增加。假设A要与人原子发生交换，其过程也只能是通过原子与空位的交换，即人移到空位位置，A移到人位置，空位移到原的位置，可见，空位移动一步之前移动了两个原子。同理，若A往几方向移动，空位移动一步须移动三个原子。所以，同等电子风力条件下，金属原子移动方向不同，难易程度也不同。 从电流密度角度，我们可以这样解释电迁移的失效机理 在金属里作用了两种对立的力。这些力被称为“直接力”和“电子风”力。直接力是一种在
电化学原理 第一章 绪论 两类导体： 第一类导体：凡是依靠物体内部自由电子的定向运动而导电的物体，即载流子为自由电子（或空穴）的导体，叫做电子导体，也称第一类导体。 第二类导体：凡是依靠物体内的离子运动而导电的导体叫做离子导体，也称第二类导体。 三个电化学体系： 原电池：由外电源提供电能，使电流通过电极，在电极上发生电极反应的装置。 电解池：将电能转化为化学能的电化学体系叫电解电池或电解池。 腐蚀电池：只能导致金属材料破坏而不能对外界做有用功的短路原电池。 阳极：发生氧化反应的电极 原电池（-）电解池（+） 阴极：发生还原反应的电极 原电池（+）电解池（-） 电解质分类： 定义：溶于溶剂或熔化时形成离子，从而具有导电能力的物质。 分类： 1.弱电解质与强电解质—根据电离程度 2.缔合式与非缔合式—根据离子在溶液中存在的形态 3.可能电解质与真实电解质—根据键合类型 水化数：水化膜中包含的水分子数。 水化膜：离子与水分子相互作用改变了定向取向的水分子性质，受这种相互作用的水分子层称为水化膜。可分为原水化膜与二级水化膜。 活度与活度系数： 活度：即“有效浓度”。 活度系数：活度与浓度的比值，反映了粒子间相互作用所引起的真实溶液与理想溶液的偏差。 规定：活度等于1的状态为标准态。对于固态、液态物质和溶剂，这一标准态就是它们的纯物质状态，即规定纯物质的活度等于1。 离子强度I ： 离子强度定律：在稀溶液范围内，电解质活度与离子强度之间的关系为： 注：上式当溶液浓度小于0.01mol ·dm-3 时才有效。 电导：量度导体导电能力大小的物理量，其值为电阻的倒数。 符号为G ，单位为S ( 1S =1／Ω)。 影响溶液电导的主要因素：（1）离子数量；（2）离子运动速度。 当量电导（率）：在两个相距为单位长度的平行板电极之间，放置含有1 克当量电解质的溶液时，溶液所具有的电导称为当量电导，单位为Ω-1 ·cm2·eq-1。 与 K 的关系： 与 的关系： 当λ趋于一个极限值时，称为无限稀释溶液当量电导或极限当量电导。 离子独立移动定律：当溶液无限稀释时，可以完全忽略离子间的相互作用，此时离子的运动 i i i x αγ=∑ =2 2 1i i z m I I A ?-=±γlog L A G κ= KV =λN c N c k 1000=λ- ++=000λλλ
一、Transwell小室制备 1. 无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl 预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
一、Transwell小室制备 1、无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜: 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN的话,可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen)的话,一般配成0、5 mg/ml,直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜: 吸出培养板中残余液体,每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液,37 ℃,30min。另有tianjin_glioma战友提供的方法:在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3、9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大,以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好),置37 ℃30 min使Matrigel 聚合成凝胶。 2、有基质胶的Transwell小室制备 Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300 μl预温的无血清培养基,室温下静置15－30 min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h,进一步去除血清的影响。但这一步并不就是必须的。 ②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1－2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105,个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力就是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为,对照组与处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组与处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的就是,下层培养液与小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。 ③培养细胞:常规培养12－48 h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度就是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞,24 h内对细胞增殖并无明显抑制,但24 h后,抑制作用就开始出现了。所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24 h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟就是由于侵袭被抑制引起,还就是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提就是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我瞧到细胞在小室内的形态不就是正常培养贴壁的形态,而就是圆形的,仍就是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以瞧到细胞不正常贴壁也不要紧张,就是正常现象 在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这就是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1－2 h把培养板从培养箱里拿出来瞧瞧,确信没有大气泡产生。
IC工艺及版图设计分类习题 Ⅰ填空题 1. 有一种称为0.13um 2P5M CMOS 单阱工艺, 它的特征线宽为 0.13um ，互连层共有 7层， 其电路类型为 CMOS 。 2. 某种工艺称为0.35um Mixed Signal 2P4M Polycide 3.3VProcess，请判断其特征尺寸为 0.35um ，互连层共有 6 层，适合（适合或不适合）于设计模拟电路。 3. 请根据实际的制造过程排列如下各选项的顺序： a. 生成多晶硅 b. 确定阱的位置和大小 c. 定义扩散区，生成源漏区 d. 确定有源区的位置和大小 e. 确定接触孔位置 正确的顺序为： bdace 。 4. N 阱 CMOS 工艺中，之所以要将衬底接 GND 、阱接到电源上，是因为阱和衬底构成的pn节反偏。 5. 版图验证主要包括三方面： LVS ， DRC ， ERC ; 完成该功能的 Cadence 工具主要有（列举出两个）：DIV A ，DRACULA 。 6. 芯片使用0.01 cmΩi P 型衬底顶部的8um 厚的10 cmΩi P 型外延层制作，计算从芯片抽取 25mA 电流需要 6.67×104 um2衬底接触面积。假设最大允许的衬底去偏置为0.3V。 7.某种铜铝合金可以安全工作于5×1 05 A/ cm2的电流密度下。如果金属层厚度为8000A o， 则10um 宽的金属连线能承受 40 mA 的电流；当通过氧化台阶时，金属层厚度减小 了50%，则该10um 宽的金属连线能承受 20 mA 电流。 8. CMOS 工艺中集成电路中的电阻主要有__电阻，扩散电阻，poly电阻_三种。 9.CMOS 工艺中某种材料工艺变化方块电阻偏差在２０％，假设特征尺寸为0.5um,工艺线宽控制维持在10%以内。假设使用1um 的线宽来绘制电阻，电阻容差 25% 。使用2um 的线宽来绘制电阻，电阻容差 22.5% 。 Ⅱ选择题 1. NMOS 器件的衬底是（B ）型半导体。 A、N 型 B、P 型 C、本征型 D、耗尽型 2. N 型半导体材料的迁移率比P 型半导体材料的迁移率（C ）。 A、相等 B、小 C、大 3. 在0.13um 集成电路技术中，铜取代铝成为最主要的互连金属的主要原因是：（AD ） A、铜具有更高的导电率； B、铜具有更低的导电率； C、铜更容易刻蚀加工； D、铜具有更好的抵抗电迁移的能力。 4. 在ICFB 中完成一个完整的集成电路版图绘制，下列哪些文件是必需的 ( ABCD ) A. Technology 文件 B. DRC 文件 C. LVS 文件 D. Display 文件 5. DRACULA 做layout 的DRC 检查后，应该打开那个文件来看错误信息？（C ） A 后缀名为drc 的文件。 B 后缀名为lvs 的文件。 C 后缀名为sum 的文件。 D 后缀名为com 的文件。 6. DRACULA 做layout 的LVS 检查后，应该打开那个文件来看错误信息？。（ B ） A 后缀名为drc 的文件。 B 后缀名为lvs 的文件。 C 后缀名为sum 的文件。 D 后缀名为com 的文件。 7. 在layout 中给金属线加线名标注，即用lable 按schematic 的Pin 的要求对所要标注的金属
迁移实验（cell migration assay） 实验介绍 细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 实验步骤： 1材料准备： 可拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基，DMEM 完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫） 2步骤和流程 2.1基质胶铺板： 用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。 2.2制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。 2.3接种细胞 ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。 ②24孔板下室一般加入600μl含20%FBS的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 2.4结果统计 直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。 取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。 0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。 400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。 实验材料
一、Transwell小室制备 1. ?无基质胶Transwell小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4 ℃风干。如果需要在下室面铺FN 的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉,吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原（collagen）的话，一般配成 0.5 mg/ml，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 ℃，30min。另有 tianjin_glioma战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60-80 μl (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 ℃30 min使Matrigel聚合成凝胶。 2. ?有基质胶的Transwell小室制备 ?Chemicon公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温下静置15－30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24 h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1－2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×105，个人认为不要超过5×105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点，所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100－200 μl加入Transwell小室，不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200 μl。 ②24孔板下室一般加入500 μl含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12－48 h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Transwell，处理时间也必须限定在24 h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达，到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1－2 h 把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。? 四、结果统计 检测穿过的细胞数有两种方法： 1. ?直接计数法 （1）“贴壁”细胞计数 这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去。 通过给细胞染色，可在镜下计数细胞
A u电迁移对电路的影 响
Au电迁移对电路的影响 电迁移是导电金属材料在通过高密度电流时，金属原子沿着电流运动方向（电子风）进行迁移和质量可控的扩散现象，它与金属材料的电流密度和温度数值密切相关。当凸点及其界面处的局部电流密度超过电迁移门槛值时，高速运动的电子流形成的电子风与金属原子发生剧烈碰撞，进行部分的冲量交换，迫使原子沿着电子流方向运动，从而发生凸点互连的电迁移。通常电迁移能在阴极造成金属原子的流失而产生微空洞，使互连面积减小导致断路，在阳极造成金属原子的堆积而形成凸起的“小丘”，导致短路，从而引起IC及元器件失效。电迁移是引起IC及电子产品失效的一种重要机制。因此，有必要针对Au的电迁移特性进行研究，明确Au电迁移对电路的影响。 某限幅低噪声放大器在交付用户使用一段时间后出现输出不稳定现象，在确认失效样品电参数后，开封检查观察到内部没有短路、断路现象或明显的缺陷区。由于放大管中主要功能元件是两级砷化镓金属半导体场效应晶体管（MESFET），采用新的同型号的MESFET将其置换后，功能恢复正常。根据以上检测排除，最终锁定场效应管失效。 笔者借助扫描电子显微镜和X射线能谱仪对该MESFET中的异常导电层不同微区进行了微观分析，找出了产生此问题的原因。 1实验
实验仪器为日本JEOL公司生产的JSM-6490LV型扫描电子显微镜（SEM），配有美国EDAX公司生产的Genesis2000XMS型X射线能谱仪（EDS）附件。 实验样品为失效的GaAs-MESFET，图1为其结构图，衬底材料是具有高电阻率的本征砷化镓，在沟道上制作栅极金属，与n型半导体之间形成肖特基势垒接触，源极和漏极金属与n+型半导体之间形成欧姆接触。该MESFET采用 n+-GaAs-Au欧姆接触系形成源漏接触电阻和Al-W-Au的砷化镓肖特基势垒接触系统。 2结果与讨论 2.1 Au导电层的微观形貌和成分对比分析
SnAgCu钎料焊点电化学迁移的 原位观察和研究 摘要: 通过恒定电压条件下的水滴实验，对Sn-4Ag-0.5Cu钎料焊点的电化学迁移（ECM）行为进行了原位观察和研究。结果表明，树枝状的金属沉积物总是在阴极上生成，并向着阳极方向生长，在接触阳极的瞬间，发生短路失效。外加电压不超过2 V 时，形成的沉积物数目往往比较少并且粗大。焊点间距的减少和外加电压的增加都会使得ECM造成的短路失效时间显著缩短。当钎料不能完全包裹焊盘或者焊盘局部位置上钎料的厚度很薄时，发生ECM的金属除了来自钎料焊点，还来自Cu焊盘；钎料中的Ag 不发生迁移。 关键词:电化学；电化学迁移；SnAgCu钎料；焊点；原位观察 电化学迁移（ECM）是一个电化学过程。在一定温度和湿度条件下，当相邻的钎料焊点或连线之间存在电位差时，就有可能发生ECM。电位较正的钎料焊点或连线上的金属失去电子，发生电化学溶解，以离子的形式进行迁移，然后在电位较负的焊点或连线上沉积下来，生成树枝状导电沉积物，使得相邻的钎料焊点或连线之间发生短路，造成严重的可靠性问题。 目前，对于电子产品的电化学迁移性能的检测标准，通常采用美国印刷电路学会（Institute of Printed Circuits，简称IPC）的IPC—TM—650 Method 2.6.14.1抗电化学迁移试验（Electrochemical Migration Resistance Test）[1]。该测试方法是将具有一定图形结构的样片，在温度/相对湿度分别为（40 ± 2）℃/（93 ± 2）%、（65 ± 2）℃/（88.5 ± 3.5）%，以及（85 ± 2）℃/（88.5 ± 3.5）%的条件下，外加10 V的直流电压进行加速试验，通过500 h考察电阻的变化来确定电子产品的抗电化学迁移性能是否合格。但是该检测试验并不能告诉我们电化学迁移究竟是怎样一个过程。
一、Tran swell 小室制备 1. 无基质胶Tran swell 小室制备 ①包被基底膜： 用50 mg/LMatrigel 1:8 稀释液包被Tran swell小室底部膜的上室面， 4 C风干。如果需要在下室面铺FN的话，可将200 ul枪头的尖端剪掉，吸取FN均匀涂抹在小室的下面。用胶原(collagen )的话，一般配成0.5 mg/ml ，直接用枪吸了涂在膜上。 ②水化基底膜： 吸出培养板中残余液体，每孔加入50ul含10g/LBSA的无血清培养液，37 C, 30min。 另有tianjin_glioma 战友提供的方法：在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel (3.9 ug/ul) 60- 80卩l (注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37 C 30 min 使Matrigel聚合成凝胶。 2. 有基质胶的Tran swell 小室制备 Chemicon 公司的ECM550系列说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300卩1预温的无血清培养基，室温下静置15 - 30 min，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。 二、制备细胞悬液 ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12 - 24 h ,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。 ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1 - 2遍，用含BSA的无血清培养基 重悬。调整细胞密度至1-10 X10 5,个人认为不要超过 5 X105。具体实验时采用密度要自己摸索，因为不同细胞，其侵袭能力是不同的。个人经验，细胞量过多，穿过膜的细胞会过多 过快，如果最后用计数法统计结果的话将难以计数；而过少的话，可能还没到检测的时间点， 所有的细胞都已穿过，因此最少也要保证在收样的时候，上室内还要有一定量的细胞存在。 个人认为，对照组和处理尽量不要分开计数，因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数，那么计数一定要多重复几次，力求准确，尽量保证 对照组和处理组细胞密度一致。 三、接种细胞 ①取细胞悬液100 —200 加入Tran swell小室，不同公司的、不同大小的Tran swell小 室对细胞悬液量有不同要求，请参考说明书。24孔板小室一般200卩l。 ②24孔板下室一般加入500 □含FBS或趋化因子的培养基，不同的培养板加的量有不同 要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一 旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出 现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。 ③培养细胞：常规培养12 —48 h (主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。 以我的课题为例，我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力，还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞，24 h内对细胞增殖并无明显抑制，但24 h后，抑制作用就开始出现了。所以，用这个浓度来做Tran swell , 处理时间也必须限定在24h内，否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡，使处理组 细胞数目少于对照组，那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少，究竟是由于侵袭被抑制引起，还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。 时间过长不可以，同样，过短也不行，因为细胞内会有一定量的MMPs储存，短时间内可 能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去，进而发挥作用，影响MMPs表达， 到最后释放到培养基中，还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点，也可选择多个时间点 研究时间依赖效应，但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外，我看到细胞 在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态，而是圆形的，仍是悬浮时的形态，不过会聚集成 团，所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张，是正常现象 在培养过程中，膜下会逐渐有少量小气泡产生，这是正常现象，可不予处理，但我遇到过培 养一段时间后，膜下出现了大气泡，幸亏及时发现，否则后果将非常严重。因此，个人建议，最好接种细胞后1—2 h把培养板从培养箱里拿出来看看，确信没有大气泡产生。
第二章电迁移与噪声评估基础 电迁移现象是由于在电流作用下金属中的离子位移所致，是金属互连中的金属原子受到运动的电子作用引起的物质输运现象。它首先表现为电阻值的线性增加，到一定程度后就会引起金属膜局部亏损而出现空洞，或引起金属膜局部堆积而出现小丘或晶须，最终导致突变失效，严重影响集成电路的寿命。电迁移问题在1960s集成电路刚刚出现时就引起了人们的注意，随着VLSI技术的发展，作为电路互连线的金属薄膜的截面积越来越小，其承受的功率密度急剧增加，使得电迁移成为集成电路最主要的失效原因之一，因此，对其进行可靠性评估也愈加显得重要。 §2.1 电迁移简介 2.1.1 电迁移现象 在半导体集成电路上，金属布线层大多采用铝淀积层。铝淀积膜是使用物理淀积方法（如真空蒸发、溅射、电子束淀积等）形成的。铝淀积膜与一般导线模式不同，参看图2-1。 图2-1. 淀积层的模式图 电迁移现象在一般使用的电线上没问题，但用于半导体器件等的淀积膜上就成问题了，这是因为在如前所述的淀积层上多，而且存在很多晶粒间界，电流密度两者相差大。如图2-2所示，半导体器件的铝布线上流过的电流密度为104-105A/cm2左右，而一般导线上流过的电流密度为103 A /cm2左右[23]。 （黄211f5.43） 图2-2. 普通导线与半导体器件中布线的差别 所谓电迁移现象是金属布线中的金属原子与通过布线层的电子相互作用引起的输运现象。金属中的金属原子渡越能量势阱，成为自由原子。可是，在这种自扩散中只是引起随机的金属原子间的重新排列而已。通过这种自由原子与电子流的相互作用（动量交换）后，金属原子才移动。金属原子活动起来的力，如图2-3所示，是由与电场同一方
Transwell侵袭实验总结 第一节概念 这里想明确两个概念，一个是Transwell，另一个是肿瘤细胞侵袭模型。 1.Transwell 关于Transwell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，well有小室的意思，可以从字面上理解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认为这是一种膜滤器（Membrane filters），也可认为是一种有通透性的支架（permeable supports）。 更准确地说，Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell小室（Transwell chamber，Transwell insert），其外形为一个可放置在孔板里的小杯子，不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验需要，可有不同选择。 但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0μm，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜（polycarbonate membrane）。 下图是一个Transwell装置的纵切面
将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。 我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。 下面参考guxuefeng战友和cosmosci战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验： （1）共培养体系： 小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0μm以下孔径。常用0.4、3.0μm。我们实验室用的是0.4μm。
电化学原理第一章绪论 两类导体： 第一类导体：凡是依靠物体内部自由电子的定向运动而导电的物体，即载流子为自由电子 电解质分类： 定义：溶于溶剂或熔化时形成离子，从而具有导电能力的物质。 分类： 1.弱电解质与强电解质—根据电离程度
2.缔合式与非缔合式—根据离子在溶液中存在的形态 3.可能电解质与真实电解质—根据键合类型 水化数：水化膜中包含的水分子数。 水化膜：离子与水分子相互作用改变了定向取向的水分子性质，受这种相互作用的水分子 注：上式当溶液浓度小于0.01mol ·dm-3 时才有效。 电导：量度导体导电能力大小的物理量，其值为电阻的倒数。 符号为G ，单位为S ( 1S =1 ／Ω)。 影响溶液电导的主要因素：（1）离子数量；（2）离子运动速度。 L A G κ=
当量电导（率）：在两个相距为单位长度的平行板电极之间，放置含有1 克当量电解质的溶液时，溶液所具有的电导称为当量电导，单位为Ω-1 ·cm2·eq-1。 与 K 的关系： 与 的关系： 或 相间：两相界面上不同于基体性质的过度层。 相间电位：两相接触时，在两相界面层中存在的电位差。 产生电位差的原因：荷电粒子（含偶极子）的非均匀分布 。 形成相间电位的可能情形： KV =λN c N c k 1000=λ
1.剩余电荷层：带电粒子在两相间的转移或利用外电源向界面两侧充电； 2.吸附双电层：阴、阳离子在界面层中吸附量不同，使界面与相本体中出现等值反号电荷； 3.偶极子层：极性分子在界面溶液一侧定向排列； 4.金属表面电位：金属表面因各种短程力作用而形成的表面电位差。
《电迁移原理》的思考总结与扩展 学号：10072120236 姓名：李旭瑞 专业：ECNU 微电子
电迁移原理： 集成电路芯片内部采用金属薄膜引线来传导工作电流，这种传导电流的金属薄膜称作互连引线。随着芯片集成度的提高，互连引线变得更细、更窄、更薄，因此其中的电流密度越来越大。在较高的电流密度作用下，互连引线中的金属原子将会沿着电子运动方向进行迁移，，其结果会使导体的某些部位产生空洞或晶须，这种现象就是电迁移。它是引起集成电路失效的一种重要机制。 电迁移失效机理 产生电迁移失效的 内因：薄膜导体内结构的非均匀性 外因：电流密度 从缺陷产生和积累得角度，我们可以这样解释电迁移的失效机理，即在电迁移过程中，在子风和应力的作用下，互连线中的某些薄弱部位产生了缺陷;缺陷的产生，重新改变了互连线中电流的分布，进而也会影响热分布;这两个过程相互作用，决定了缺陷在哪些薄弱部位产生;随着时间的增加，缺陷不断积累，相邻较近的缺陷融合成一个大缺陷;当产生的缺陷足够大，在垂直电流的方向上占有足够的面积，互连线的电阻就会显著增加;最后当形成的缺陷横跨整个互连线横截面，互连线断路在图2.4中，我们考虑金属原子A，它的周围有十二个相邻的晶格位置，其中之一被空位V占据，其余被其他金属原子占据。在无电流应力条件下，由于热运动，原子A向其附近任何一个方向移动的概率是相等的;若在“电子风”吹动的情况下，很明显原子A向电子风方向移动概率大大增加。假设A要与人原子发生交换，其过程也只能是通过原子与空位的交换，即人移到空位位置，A移到人位置，空位移到原的位置，可见，空位移动一步之前移动了两个原子。同理，若A往几方向移动，空位移动一步须移动三个原子。所以，同等电子风力条件下，金属原子移动方向不同，难易程度也不同。
金属是晶体，在晶体内部金属离子按序排列。当不存在外电场时，金属离子可以在品格内通过空位而
电迁移寿命。但是封装法的缺点是显而易见的，首先封装就要花费很长的时间，同时，用这种方法时通过金属线的电流非常小（为了抑制焦耳热，使得金属线的温度近似于环境温度），测试非常花费时间，一般要好几周。2，晶圆级电迁移测试（Wafer-level ElectroMigration)。 a ，自加热法。因为在用封装法时，炉子的温度被默认为就是金属线温度，如果有很大的电流通过金属线会使其生很大的焦耳热，使金属线自身的温度高于炉子的温度，而不能确定金属线温度。所以，后来发展了自加热法。方法不用封装，可以真正在硅片级测试。它是利用了金属线自身的焦耳热使其升高。然后用电阻温度系数 （temperature coefficient of resistance, TCR ）确定金属线的温度。在实际操作中，可以调节通过金属线的电流来调它的温度。 b ，多晶硅加热法。实际应用表明，这种方法对于金属线的电迁移评价非常有效，但是对于通孔的电迁移评价方法就不适用了。因为，过大的电流会导致通孔和金属线界面处的温度特别高，从而还是无法确定整个通孔电迁移测试结构的温度。针对这种情况，又有研究者提出了一种新的测试结构——多晶硅加热法。这种方法是利用多晶硅为电阻，通过一定电流后产生热量，利用该热量对电迁移测试结构进行加热。此时，多晶硅就相当于是一个炉子该方法需要注意的是在版图设计上的要求比较高，比如多晶硅的宽度，多晶硅上通孔的数目等都是会影响其加热性能的。 自加热法是目前的FOUNDRY 工厂采用的主流测试方法。自加热法的测试结构如下。测试过程依据JESD87。开尔文连接有两个要求：对于每个测试点都有一条激励线F 和一 条检测线S ，二者严格分开，各自构成独立回路；同时要求S 线 必须接到一个有极高输入阻抗的测试回路上，使流过检测线S 的 电流极小，近似为零。图中r 表示引线电阻和探针与测试点的接 触电阻之和。由于流过测试回路的电流为零，在r3， r4 上的压 降也为零，而激励电流I 在r1，r2 上的压降不影响I 在被测电阻 上的压降，所以电压表可以准确测出Rt 两端的电压值，从而准 确测量出R t 的阻值。测试结果和r 无关,有效地减小了测量误差。 按照作用和电位的高低，这四条线分别被称为高电位施加线 （HF ）、低电位施加线（LF ）、高电位检测线（HS ）和低电位 检测线（LS ）。注：测定电压的时候，采取的是开尔文测试方法，也称四线法。