生物工程专业综合实训
（2016 年 11 月
谷氨酸生产工艺
摘要：
谷氨酸做为一种人体所必须的氨基酸，在生命的生理活动周期中具有很大的作用。
不仅参与各种蛋白质的合成，组成人体结构，还做为味精可以给我们带来味蕾上的享受。
现代生产谷氨酸的工艺主要是利用微生物发酵提取而来。
不同的发酵方法和不同的发酵条件会造成产量的很大不同。
本次谷氨酸的生产工艺，主要是掌握发酵方法和发酵条件的控制，还有各种仪器的使用方法。
通过测得的数据来观察菌种的生长变化，同时谷氨酸发酵工艺各个工段的原理和使用方法。
关键词：谷氨酸；发酵；工艺；等电点。
引言
谷氨酸是一种酸性氨基酸，是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。
不论在食品、化妆品还是医药行业，谷氨酸都有很大的用途。
谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。
医学上谷氨酸主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。
食品工业上，味精是常用的仪器增鲜剂，其主要成分是谷氨酸钠盐。
过去生产味精主要用小麦面筋（谷蛋白）水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产。
不论在食品、化妆品还是医药行业，谷氨酸都有很大的用途。
谷氨酸钠俗称味精，是重要的鲜味剂，对香味具有增强作用。
谷氨酸钠广泛用于食品调味剂，既可单独使用，又能与其它氨基酸等并用。
用于食品内，有增香作用。
甘氨酸具有甜味，和味精协同作用能显着提高食品的风味。
谷氨酸作为风味增强剂可用于增强饮料和食品的味道，不仅能增强食品风味，对动物性食品有保鲜作用。
一、谷氨酸简介
谷氨酸一种酸性氨基酸。
分子内含两个羧基，化学名称为α-氨基戊二酸。
谷氨酸是里索逊1856年发现的，为无色晶体，有鲜味，微溶于水，而溶于盐酸溶液，等电点3.22。
大量存在于谷类蛋白质中，动物脑中含量也较多。
谷氨酸在生物体内的蛋白质代谢过程中占重要地位，参与动物、植物和微生物中的许多重要化学反应。
医学上谷氨酸主要用于治疗肝性昏迷，还用于改善儿童智力发育。
食品工业上，味精是常用的仪器增鲜剂，其主要成分是谷氨酸钠盐。
过去生产味精主要用小麦面筋（谷蛋白）水解法进行，现改用微生物发酵法来进行大规模生产。
谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。
L －谷氨酸是蛋白质的主要构成成分，谷氨酸盐在自然界普遍存在的。
多种食品以及人体内都含有谷氨酸盐，它即是蛋白质或肽的结构氨基酸之一，又是游离氨基酸，L型氨基酸美味较浓。
L－谷氨酸又名“麸酸”或写作“夫酸”，发酵制造L－谷氨酸是以糖质为原料经微生物发酵，采用“等电点提取”加上“离子交换树脂”分离的方法而制得。
谷氨酸产生菌主要是棒状类细菌，这类细菌中含质粒较少，而且大多数是隐蔽性质粒，难以直接作为克隆载体，而且此类菌的遗传背景、质粒稳定尚不清楚，在此类细菌这种构建合适的载体困难较多。
需要对它们进行改建将棒状类细菌质粒与已知的质粒进行重组，构建成杂合质粒。
受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株，特别是选用谷氨酸缺陷型变异株为受体，便于从转化后的杂交克隆中筛选产谷氨酸的个体，用谷氨酸产量高的野生菌或变异菌作为受体效果更好。
供体菌株选择短杆菌及棒杆菌属的野生菌或变异株，只要具有产谷氨酸能力都可选用, 但选择谷氨酸产量高的菌株作为供体效果最好。
这样就可以较容易地在棒状类细菌中开展各项分子生物学研究。
有了合适的载体及其转化系统后，就可通过DNA体外重组技术进行谷氨酸产生菌的改造。
这对以后谷氨酸发酵的低成本、大规模、高质量有较大的发展空间。
二、实训内容
菌种的培养、种子扩培、发酵、提取、脱色结晶干燥、谷氨酸成品
三、实验材料
（一）菌种：天津棒杆菌
（二）药品：胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、NaOH、葡萄糖、尿素、硫酸镁、磷酸二氢钾、D-生物素、硫酸亚铁、硫酸锰、消泡剂、氨水、
1mol/LHCl、蒸馏水、1mol/LNaOH、无水乙醇
（三）设备：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、发酵罐、721分光光度计、离心机、磁力搅拌器、天平、恒温振荡摇床
四、实验方法
（一）斜面菌种制备
无菌条件下，从冷藏的天津棒杆菌的斜面上，挑取适量菌体涂在LB培养
基的斜面上，然后置37℃的恒温箱培养20—24h。
我们采用LB培养基制
作固体试管斜面，它是一种常用培养基，LB培养基灭菌条件：在高压蒸
汽灭菌锅内保持121℃，0.14Mpa下，20min即可，分装试管，每试管约5—10ml（视试管大小而定）。
（二）种子培养基的制备与灭菌
表2 一级种子培养基配方表（400mL）
成分配比
葡萄糖 2.5%(10g)
尿素0.5%(2g)
硫酸镁0.04%(0.16g)
磷酸二氢钾0.1%(0.4g)
D-生物素(2.5-3.5)2.8mg/L
2⨯106-g/L
硫酸亚铁
2⨯106-g/L
硫酸锰
调pH值7.0，121℃,0.14Mpa下，灭菌20min即可。
一级扩培：32℃,180—200r/min，培养10—12h。
(三)发酵培养基配方表
表3 发酵培养基配方表（2L）
成分浓度
葡萄糖125-150g/L（250g-300g）
20g/L(40g)
尿素
1-1.5g/L(2.5g)
磷酸二氢钾
0.25-1.0g/L(1.1g)
硫酸镁
2⨯106-g/L
硫酸亚铁
2⨯106-g/L
硫酸锰
D-生物素(0.4—0.8)0.6mg/L
按发酵培养基成分配比，配制培养基，调节pH值至6.5，进行灭菌。
灭菌条件：在高压蒸汽灭菌锅内保持121℃，0.14Mpa下，灭菌20min即可。
四、发酵过程
发酵液2.0L装入发酵罐，离座灭菌。
接入电源，将已灭菌的发酵培养基通入无菌空气，调整好发酵罐的各类初始参数：温度为32℃、pH7.5、搅拌180r/min、泡沫和消泡剂（豆油）自动调节等。
12h后观察是否生长杂菌，再将无水乙醇倒入接种口的环槽中，点燃后，进行无菌接种操作，接种量一般为10%。
通气量为0.8—1.0m /h，搅拌速率为60r/min，全程用消泡剂消泡，发酵过程通氨，当接种后发酵pH低于6.5时就可以开始通氨，通氨量的多少参考pH值，温度采用变温控制，具体过程见表4。
谷氨酸的发酵周期约为30h，每隔2h测一次天津棒杆菌的菌丝浓度，采用721分光光度计在620nm下测发酵液OD值，同时测定pH 值。
在菌体接近衰亡期前放罐，得到谷氨酸发酵液。
表4 发酵过程工艺控制
时间/h 温度/℃pH 搅拌速度/min1-
0—6 32 7.5 250
6—10 32 7.2 300
10—23 34 7.2 300
五、谷氨酸提取方法-等电点
将放罐的发酵液先测定放罐体积、pH、谷氨酸含量和温度。
取400ml发酵液，其余的装入锥形瓶封好放入冰箱中保存待用。
离心（转速为5000r/min）去除菌体。
加入盐酸溶液（1mol/L）,调节发酵液pH值为4～4.5，开搅拌，育晶2h。
之后再加盐酸溶液（1mol/L），调节发酵液pH值为3.5～3.8，育晶2h。
然后再加盐酸溶液（1mol/L），调节发酵液pH值为3.0～3.2，育晶16h，静置沉淀，母液和谷氨酸晶体分离。
六、实验结果（OD值及PH值）
七、结果讨论
1.在整个发酵过程OD值一直是负的，可能是以下几点原因造成的：
（1）在菌种摇床扩培阶段培养时间过短，造成菌种数量不够。
（2）在发酵罐接入菌种培养后，有一段时间内发酵罐温度过高可能造成细菌大量死亡，导致细菌产物减少或根本没有。
（3）发酵过程条件没有控制好，过酸或过碱都会导致菌种生长不良。
2.在调节发酵液pH值可能由于试纸测量不太精准。
导致发酵条件不好，产物没有提取不出来。
3.在本实验中灭菌十分重要，如果灭菌不彻底，导致杂菌污染。
杂菌会和菌种争夺养分导致菌种生长不良，其次杂菌的代谢产物可能威胁菌种的生理活性。
八、心得体会
经过一个多星期的谷氨酸生产综合实训，让我学到很多知识。
书中学到的理论知识可以很好的转换为实践，加深我脑海中的知识。
本次实验涉及多个方面，不再是以前单一因素对实验的影响，而是多个因素:通气量，pH，温度，营养物质等共同作用来生产谷氨酸。
任意一个因素的改变都会造成谷氨酸的产量变动很大。
当然菌种的生理活性和数量也是一个重要因素，生理活性高意味着产量就高。
整个发酵过程不断通入氧气，保障菌种可以很好进行有氧呼吸将葡萄糖转换为谷氨酸，并且通气量是随着时间而改变的。
当菌种生长到一定时期，菌种数量就基本不变。
而就行初级代谢和次级代谢来产生谷氨酸。
其中整个发酵过程中OD值一直是负的，并且最后也没有谷氨酸产生。
最大的可能性就是发酵液中的菌种数量太少或者可能由于某种因素菌种死掉了如温度过高，pH。
最后要感谢张欣老师在整个发酵过程对我们的耐心指导和陪伴。
