食品微生物8 微生物分离、纯化与保藏技术

（一）菌种保藏的目的

保持其原有性状和活力的稳定； 确保菌种不死亡、不变异、不被污染；
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菌种的保藏与菌种管理
（二）菌种保藏依据：
根据菌种的生理、生化特点，人为地创造低温、干燥、 缺氧、缺乏营养条件，使菌种的代谢活动和生长繁殖处 于受抑制的休眠状态。 保藏菌种的选取：选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢 子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
•斜面低温保藏法 • 砂土管保藏法 •石蜡油封藏法 •冷冻真空干燥保藏法 •滤纸保藏法 •甘油悬液保藏法 •液氮超低温保存
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菌种的保藏与菌种管理
微生物菌种的分离纯化
分离：
1、倾注平板法
先加菌
注意培养基温度，混合均匀
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微生物菌种的分离纯化
分离：
2、涂布分离法
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微生物菌种的分离纯化
3、平板划线法
1) 倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。 2）划线方法
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微生物菌种的分离纯化
二、实训原理
分离纯化技术是微生物学中重要的基本技术之一。 分离纯化：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方 法。
纯种（纯培养）：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢 子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
思考与讨论 1．如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养？ 2. 接种环（针）接种前后烧灼的目的是什么？为什 么在接种前一定要将其冷却？如何判断烧灼过的接种 环已冷却？
模块二：微生物检验基础技能训练
8 微生物分离、纯化与保藏技术
8.2 微生物菌种的保藏
广东食品药品职业学院 食品科学系
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法： 4、真空冷冻干燥法
低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥、封装， 隔绝空气，微生物的生长和酶活动停止。达到长期保藏的 目
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
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菌种的保藏与菌种管理
二、菌种的复壮 (一)菌种的提纯 (二)通过寄主体进行复壮
(三)淘汰已衰退的个体
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菌种的保藏与菌种管理
(一)菌种的提纯
从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离 出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研 及生产使用。 菌种提纯：
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菌种的保藏与菌种管理
一、菌种退化
菌种退化：菌种在自发突变的影响下，引起某些优良特性 降低或丧失的现象。
生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降；
菌种衰退原因：基因突变
菌种保藏与复壮工作:为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退
真空冷冻干燥法优点： 具低温、干燥、除氧主要因素，适用于除丝状真菌的菌 丝体外的其它各类微生物。 菌种存活时间长、效果好，一般可保存 5 年以上，有的 可保藏15年以上不发生变异。
冻干保藏的效果因微生物种类而异，一般是细菌＞放线菌＞真菌
体积小、不易污染、便于运输，为最广泛的菌种保藏法。
只要求达到菌落纯化的水平，通过稀释平板法、划线法、 表面涂血法等常规操作法，适用于退化不太严重的情况。
要求达到“细胞纯”的水平，采用单胞分离法，也可二 者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞 分离法进一步纯化。
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菌种的保藏与菌种管理
1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
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8 微生物分离、纯化和保藏技术微生物菌种的分离纯化4、富集分离法 利用选择培养基
创造只让所需微生物生长的条件，所需微生物有效地与其他 微生物竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。 所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、 渗透压和氢受体等。经过多次重复移种，最后富集的菌株很 容易在固体培养基上长出单菌落。
菌落4
菌落5
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微生物常规鉴定、筛选
1、微生物菌落特征 1）肉眼观察 湿润，正反面 颜色一致
小、扁平或隆起
细菌 酵母菌 放线菌 霉菌
菌落
干燥，正反、 中央与边缘
大、扁平或隆起
小、而致密
大、疏松、 颜色不一致
2）细致区分还要用显微镜，观察细菌形态。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
矿油保藏法特点：
适用于各大类不产孢子的微生物菌种的中期保藏 不适用于能分解烃类的菌种的保藏。 主要保藏措施是低温、阻氧。 一般可保存1～2年左右。
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＞藻类，而菌丝体不宜用此法保存。
冷冻真空干燥操作流程
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微生物菌种的分离纯化
四、实训方法与步骤
取样 制备稀释液 分离
0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1 ml
0.1m l
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沙土按 3 ： 2 或 1 ： 1 混合装入指形管或高 100mm ，直径为 10mm的小试管，高约1cm(约2g)，塞棉塞121℃湿热灭菌1h， 也可170℃2h干热灭菌(或蒸汽三次间歇灭菌)，烘干。 经肉汤检查确实证明无菌即可使用。
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(三)菌种保藏方法： 1.斜面低温保藏法－－常用保藏法 菌种接种斜面培养基 生长健壮的菌种 定期移植至新培养基
4℃左右的冰箱中保藏
继续保藏
适用菌种的短期保藏
特点
一般可保存1～6个月左右。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
保藏期短 传代次数多 易发生变异 易被污染
(二)通过寄主体进行复壮
对于寄生性微生物如苏云金杆菌、白僵菌、多角体病毒 等，由于长期使用，其毒力下降，导致杀虫效率降低及 衰退现象。 可以用菌种去感染菜青虫幼虫等，然后从致死的虫体上 重新分离，经过几次重复感染与分离，就可以逐步恢复 和提高毒力。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)淘汰已衰退的个体
通过物理、化学的方法处理菌体 ( 或孢子 ) ，使大部 分死亡(80%以上)，存活的菌多为生长健壮者，可从 中选出优良菌种来。
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菌种的保藏与菌种管理
三、菌种保藏
菌种保藏：是使微生物种子经过长时间保存后，尽可能保 持其原来性状和活力不变，不死亡、不污染
如分离专性寄生菌，须把样品接种到相应敏感宿主细胞群中， 使其大量生长。多次重复移种便可得到纯的寄生菌。
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微生物菌种的分离纯化
５、厌氧法
利用装原培养基的试管作培养容器，在沸水浴中加热数分钟， 逐出培养基中的溶解氧。快速冷却，并进行接种。 加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。或在 接种后，用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上试 管口密封。
为了更有效地分离某些厌氧菌，可把所分离的样品接种于培 养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。
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第一节 微生物菌种的分离纯化
五、实训结果
（一）菌落观察
菌落 菌落1 菌落2 菌落3 大小 形状 表面 边缘 湿润度 透明度 色素 菌名

微生物移接方便，经济简便。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
3、矿油保藏法（石蜡油低温保藏法）
长好的斜面菌→覆盖灭菌液体石蜡 →菌体与空气隔绝→ 直 立保藏于-4～4℃低温或室温 注意事项：
斜面培养菌种，斜面不宜过长； 纯净优质石蜡油，置三角烧瓶经 121℃高压蒸汽灭菌 1 ～ 2h ， 放烘箱中(160℃左右)干热处理，除灭菌时渗入水分，待石蜡 油变清澈透明后冷却即可加入斜面，斜面上不能出现气泡， 液蜡添加量以高出斜面顶部约1cm左右为宜。
菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
沙土管保藏流程：
菌种 斜面产孢 孢子悬浮液（≥106/ml ） 减压干燥
加入沙土管（ 0.3～0.5ml/管） 密封 4℃低温保藏
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法：
砂土管保藏法的特点
包藏初期，菌死亡率高，后逐渐减慢，存活下来的孢子在以后 保存期间稳定性较好。 适用于产孢子的微生物及形成芽孢的细菌 对于一些对干燥敏感的细菌及酵母则不适用。
模块二：微生物检验基础技能训练
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8.1 微生物菌种的分离纯化
食品微生物
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微生物分离、纯化与保藏技术
第一节 微生物菌种的分离纯化
一、实训目的：
（1）学习并掌握微生物分离纯化的原理和分离纯化的 技术。 （2）学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
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第二节 微生物常规鉴定、筛选
（二）微生物常规鉴定 2、微生物生理生化反应
1）营养要求：采用选择培养基 2）酶：产酶种类和反应特性 3）代谢产物：种类，产量，显色反应等
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微生物菌种的分离纯化
优点:
简便易行 容易推广 存活率高；
缺点:
•一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法： 2、沙土管保藏法
沙土管的准备：
河 (海 )沙过 24目筛， 10 ％盐酸浸泡 24h，去盐酸，水冲洗至 pH中性，去水烘干或晒干。取菜果园土粉碎过筛，烘干。
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菌种的保藏与菌种管理
一、菌种退化
菌种退化：菌种在自发突变的影响下，引起某些优良特性降低或 丧失的现象。 菌种衰退原因：基因突变 菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降； 菌种保藏与复壮工作:为菌种创造良好条件，减缓菌种衰退
微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生 物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。
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微生物菌种的分离纯化
三、实验材料

样品：


细菌：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌
放线菌：细黄链霉素 酵母菌：啤酒酵母

霉菌;黑曲霉

培养基：普通琼脂斜面和平板，营养肉汤 仪器与用具：接种环、接种针、试管架、酒精灯、记号笔、 标签、火柴、灭菌培养皿、无菌水、菌种等。
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菌种的保藏与菌种管理
(三)菌种保藏方法： 砂土管保藏法的优点

具低温、干燥、隔氧和少营养物等条件 保藏期较长、效果较好。某些抗生素产生菌保藏期 可达18年(土霉素和链霉素产生菌)到22年(新霉素产 生菌)，但对利福霉素、卡那霉素、四环素等容易产 生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。