棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶的乳酸乳球菌表达黄建飞，成丽丽，李娜，司丽芳，罗立新（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）摘要：构建棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶食品级分泌表达载体并在乳酸乳球菌MG1363（ctis MG1363）中实现表达。
通过PCR 扩增ctis MG1363基因组中分泌信号肽Usp45、质粒pLEB590的乳链菌肽（Nisin ）抗性基因NisI 和质粒pPIC9k-Abgl 的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶基因Abgl ，PCR 方法连接后获得片段Usp45-Abgl-NisI ，将其克隆到质粒pMD19中，CaCl 2法转化到E.coli DH5α，测序鉴定后将该片段连接到大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e 中并转化到E.coli XL1-Blue ，得重组子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI 。
通过PCR 方法敲除质粒pMG36e-Usp45-Abgl-NisI 中红霉素抗性基因以构建食品级分泌载体pMG36N-Usp45-Abgl-NisI ，将其电转到ctis MG1363中。
转化子E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI 能将β-葡萄糖苷酶分泌到胞外使七叶苷平板显色，ctis MG1363/ pMG36N-Usp45-Abgl-NisI 能在20 IU/mL Nisin 上生长，经RT-PCR 验证β-葡萄糖苷酶在乳酸乳球菌中实现表达。
表明分泌型表达载体构建成功，为其在乳酸乳球菌中实现食品级活性表达奠定基础。
关键词：棘孢曲霉；β-葡萄糖苷酶；大肠杆菌；分泌表达；乳酸乳球菌文章篇号：1673-9078(2014)5-33-37Food-grade Expression of β-Glucosidase from Aspergillus aculeatus inLactococcus lactisHUANG Jian-fei, CHENG Li-li, LI Na, SI Li-fang, LUO Li-xin(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)Abstract: The food-grade secretion expression vector of β-glucosidase from Aspergillus aculeatus was constructed and expressed in Lactococcus lactis MG1363. Secretion signal peptide Usp45 from the L. lactis MG1363 genome, Nisin resistance genes NisI from plasmid pLEB590 and Abgl from plasmid pPIC9k-Abgl were amplified by PCR and ligated to construct the Usp45-Abgl-NisI fragment. The fragment was subcloned into plasmid pMD19 and then transformed into E.coli DH5α by CaCl 2 method. It was identified by sequencing and inserted into the E.coli -Lactic acid bacteria shutter vector pMG36e. The recombinant strain E.coli XL1-Blue/pMG36e-Usp45-Abgl-NisI was obtained by transformation. Food-grade secretion expression vector pMG36N-Usp45-Abgl-NisI, in which erythromycin resistance gene of plasmid pMG36e-Usp45-Abgl-NisI was knocked out by PCR method, was constructed and then electrotransformed into L. lactis MG1363. β-Glucosidase produced by E.coli XL1-Blue was active on the chromogenic substrate aesculin. ctis MG1363/pMG36N-Usp45-Abgl-NisI could grow on the plates containing 20IU/mL Nisin. β-Glucosidase expressed in ctis MG1363 was verified by RT-PCR.Key words: Aspergillus aculeatu s; β-glucosidase; Escherichia coli ; secretion expression; Lactococcus lactisβ-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase ，EC 3.2.1.21）是一类能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应配基的水解酶，广泛存在于植物、昆虫、酵母、木霉、曲霉及细菌体内[1]，除水解作用外还具有转糖苷作用并合成烷基糖苷[2]。
棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus No. F-50）具有3种β-Glucosidase ，其中β-Glucosidase-1,-2不仅对可溶性纤维低聚糖如纤维三糖至纤维六糖，而且对平均聚合度为20不溶性纤33收稿日期：2013-12-31基金项目:广东省农业攻关计划项目（2006B20501001）作者简介:黄建飞(1988-)，男，硕士研究生，研究方向：分子技术及发酵 通讯作者:罗立新(1966-)，男，教授，研究方向：微生物学及发酵维低聚糖有活性。
β-Glucosidase-1促进无定型纤维的水解，产物只有葡萄糖[3]，广泛用于纤维素类物质的降解。
已有大量研究报道利用β-Glucosidase 水解释放茶叶等饮料中的香气成分，改善茶汁、果汁、酒类等的风味，提高饮料的品质[4]。
棘孢曲霉β-Glucosidase-1具有水解活性强以及产物单一特点被广泛关注，在毕赤酵母中表达比较成熟，这主要是由于对毕赤酵母的研究比较透彻以及属于真核生物，具有一套完整的修饰系统。
但在毕赤酵母中的表达需要甲醇诱导，限制其在食品领域的应用。
乳酸菌（Lactic acid bacteria ）是一类可发酵碳水化合物并产生大量乳酸的革兰阳性细菌的统称，被公34认为安全的食品级微生物（generally regarded as safe ，GRAS ）。
作为乳酸菌的模式菌乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ，ctis ），其乳脂亚种MG1363的完整基因组测序在2007年就已完成，一系列基于ctis 的表达系统已经构建，某些异源蛋白、细胞因子和酶以各种形式得到表达[5]，为其在食品工业、生物制药和疫苗研究领域奠定基础[6]。
分泌型表达具有避免被胞内蛋白酶降解的优点而深受重视，ctis 中主要胞外蛋白的分泌信号肽Usp45是由27个氨基酸组成的短肽，广泛用于异源蛋白在ctis 中分泌表达[7]。
乳链菌肽（Nisin ）由部分乳酸乳球菌乳酸亚种（ctis ctis ）产生。
成熟的Nisin 分子含有34个氨基酸，对大多数革兰氏阳性菌起抑制作用，是一种高效无毒的食品添加剂。
目前研究发现乳酸乳球菌抗Nisin 主要有下面两种机制：一种是Nisin 产生菌携带的编码Nisin 抗性基因nisI [8]，另一种是有些乳酸乳球菌自身不产Nisin ，但具有编码Nisin 的抗性基因nsr [9]。
ctis MG1363对Nisin 比较敏感，在20 IU/mL Nisin 中可完全抑制其生长。
pMG36e 是乳酸菌-大肠杆菌穿梭载体，广泛用于外源基因在乳酸菌中的异源表达，但质粒中所携带的红霉素抗性基因限制了其在食品领域的应用。
本实验首次尝试将棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶-1克隆到质粒pMG36e 中，用食品级筛选标记NisI 来代替pMG36e 中红霉素筛选标记以构建食品级分泌载体进行食品级表达。
1 材料与方法1.1 菌株、质粒和培养条件菌种E .coli DH5α、E .coli XL1-Blue 、ctis MG1614和质粒pLEB590、pPIC9k-Abgl ，为本实验室保存；菌株ctis MG1363和质粒pMG36e ，由Jan.Kok 教授惠赠；克隆载体pMD19-T ，购自大连Takala 公司；大肠杆菌采用LB 培养基，37 ℃振荡培养；ctis MG1363和ctis MG1614采用GM17培养基（M17培养基，0.5%葡萄糖），30 ℃静置培养；氨苄青霉素和红霉素在大肠杆菌中的使用浓度分别为100 μg/mL 和200 μg/mL ，红霉素和乳链菌肽在ctis MG1363中使用的浓度分别为5 μg/mL 和20 IU/mL 。
1.2 主要试剂和材料限制性内切酶XbaI 、BglII 、SphI 、XhoI 、ClaI ，PrimeSTAR 聚合酶，T4DNA 连接酶，DNA Marker ，Trizol 试剂和PrimeScript RT reagent Kit 购自Takala 公司。
质粒抽提试剂盒，DNA 回收纯化试剂盒以及基因组提取盒为Promega 公司提供。
电击杯购自BioRad 公司。
试验中所用引物见表1（其中P7与P8一对引物为敲除质粒pMG36e 中红霉素基因所设计，下划线序列为酶切位点）,由Invitrogen 公司合成，其它化学试剂均为分析纯。
表1 实验中所用引物 Table 1 Primers used in this study基因 引物序列（5´→3´）片段长度/bpUsp45 P1：GCTCTAGAACCGAACTTAATGGGAGG （XbaI ） 136 P2：GAAGATCTAGCGTAAACACCTGACAACG （BglII ） Abgl P3：GAAGATCTATGGATGAACTGGCGT （BglII ） 2545 P4：CCATCGATTTATTGCACCTTCG （ClaI ）NisI P5：CCATCGATCTTAAGGAGGGAAGAGGAAATGA （ClaI ） 830 P6：ACATGCATGCATCCCTAGTTTCCTACCTTCG （SphI ）P7：CCGCTCGAGGTTAAGGGATGCATAAACTG （XhoI ） P8：CCGCTCGAGTA TAACCCTCTTTAA TTTGGT （XhoI ）1.3 基因片段扩增根据GenBank （Accession ：M60178.1）公布的ctis MG1363Usp45基因序列和GenBank （Accession ：X76884）公布的NisI 基因序列设计引物P1、P2和P3、P4，并分别以ctis MG1363基因组和质粒pLEB590为模板扩增得到Usp45和NisI 。
