低温空气等离子体对医用聚四氟乙烯灭菌效果及其机理的研究1陈纯，胡淼，陈杰瑢*西安交通大学能源与动力工程学院，西安（710049）E-mail：jrchen@摘要：本文采用Langmuir双电子探针和电子自旋共振（ESR）诊断技术分别定量测定了远程低温空气等离子体场中各活性物种的分布。
考察了低温空气等离子体对医用聚四氟乙烯(PTFE)表面大肠杆菌的灭活效果，并通过对灭菌后细胞破碎情况观察，细胞泄漏物质检测，反应腔温度变化和紫外线对灭菌影响等分析其灭菌机理。
研究结果表明，空气等离子体能够在不超过120s的短时内杀灭99.9%以上的大肠杆菌，其灭菌效果受等离子体处理参数(放电功率、放电时间、气体流量)的影响。
本实验条件下，空气等离子灭菌的最适宜操作参数为，放电功率100W，空气流量40sccm，放电时间120s，在放电区0cm处，灭菌效果达到99.96%。
通过细胞形态学的观察和蛋白质泄漏量检测，结果证实等离子体处理后的大肠杆菌细胞肿胀、疏松，因此可以得出空气等离子体对大肠杆菌的灭菌机理为，电子、离子、自由基等活性粒子作用于细胞壁和细胞膜，使之肿胀、疏松、断裂，通透性增加，内容物流出是导致大肠杆菌死亡的直接原因。
关键词：低温空气等离子体；大肠杆菌；灭菌机理；聚四氟乙烯1. 引言近年来，对应于临床医学和人类生存环境的要求，低温等离子体灭菌以其快速、低温、无损材料基质、干式无污染等特点[1-3]，在消毒医学、材料科学、军事等领域中的应用研究引起国内外学者的广泛关注。
因其能够克服传统方法使用中的缺陷，实现灭菌技术的“绿色化”[2]，被认为是新一代最有前途的灭菌技术。
但迄今为止，关于其灭菌机理的研究，仍停留在只是以等离子体场中活性物种混存下的表观反应结果为依据做出的推测[3]，尚未能建立起具有普遍说服力的灭菌机理。
我们提出利用远程等离子体场，以实现其活性物种（电子、离子、自由基）的有效分离，从而解明它们各自在灭菌中的作用规律。
2. 实验装置与方法2.1 实验装置如图1所示，自行研制的远程低温等离子体反应器由进气系统、反应室、抽气系统和射频电源及电极组成。
射频电源为SY-500W型晶控射频功率源，频率13.56MHz，输出功率连续可调，与SP-Ⅱ型射频匹配器配合。
采用电感耦合放电方式，通过调整电感耦合可使电源反射功率接近于0。
反应室为长1m、直径45mm的硬质玻璃管，在感应线圈处放电，在准理想管式反应器中，等离子体沿一维方向向远端扩散，形成远程等离子体。
1本课题得到国家自然科学基金(编号:30571636),高等学校博士学科点专项科研基金(编号:20060110901)的资助。
图1 远程等离子体反应器结构示意图1.贮气罐2.进气阀门3.质量流量计4.电感线圈5. 反应室6. 试样7.热偶真空计 8.电磁阀 9.真空泵 10.射频电源 11.接地保护 12.射频匹配网络2.2 实验方法2.2.1 Langmuir 双电子探针与ESR 诊断将Langmuir 探针导杆与等离子体反应器相连，探针位置可调。
通过函数记录仪获得探针两端电压与流经探针电流之间的伏安特性曲线，从而求得等离子体空间的离子浓度[4]。
以清洁天然羊毛为等离子体自由基捕捉剂[5]，置于距电感线圈中点不同距离处的载物板上进行处理，处理后试样常温保存24h ，采用ESR 波谱议（ESP-500型，BRUKER 公司）进行自由基浓度测定。
测定条件：室温、微波频率9.8GHz 、微波功率3.177mW ，调制幅度0.2mT 、调制频率100kHz 、时间常数为163.84ms 、增益60、扫描时间163.84ms 。
2.2.2 等离子体灭菌实验将大肠杆菌（ATCC8099株）斜面培养24h 的菌苔用磷酸盐缓冲液(PBS)振荡洗脱，稀释配成适宜浓度的菌悬液，取0.01mL 均匀涂于25×25mm 医用PTFE 表面（预先进行脱脂、漂洗、灭菌），晾干备用[6,7]。
实验时，先将一部分染菌样片直接置于距电感线圈中点不同距离处（0，20，40，60，80cm ）的载物板（预先清洗干净并烘干灭菌）上，在不同放电功率、时间、空气流量下进行处理。
处理后的样片（阳性对照不经处理）经充分振荡洗脱成菌悬液，取样进行活菌培养计数。
灭菌效果（Germicidal Effect ，GE ）按下式计算[8]。
0log log t GE N N =−式中，N 0为阳性对照组样品生长菌落数(cfu)；N t 为实验组生长菌落数(cfu)。
2.2.3 细胞破碎情况检测采用Motic 数码显微镜（DMB5–223IPL 型，Motic 仪器中国厦门公司）观察空气等离子体处理前后的大肠杆菌形态[9]。
2.2.4 细胞泄漏物质检测细胞内的物质如核酸、蛋白质等都具有紫外吸收性质，核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶，其吸收峰在260nm 波长处，蛋白质的吸收峰在280nm 波长处。
在紫外吸收光谱（Agilent–8453型，美国Agilent 公司）下测定[10,11]，测定经等离子体处理不同时间后细胞菌悬液中的紫外吸收物质含量变化，判断是否细胞膜受到损伤破裂使得细胞内物质泄漏。
取出距放电中心不同位置的染菌PTFE 样片5片，分别置于5个装有5 mL PBS 的50 mL 烧杯内，未处理的载波片置于1个装有5 mL PBS 的50 mL 烧杯内，振荡洗涤十分钟，将洗涤液倒入6支塑料试管中，放置于离心机内，在转速为3000r·min-1下离心15min。
用微量枪取上层清夜1.0mL加入试管中，再加入5.0 mL的考马斯亮蓝G-250试剂并摇匀，放置5min 后，在A595下比色，纪录A595，根据所测的A595从标准曲线上查得蛋白质的含量。
蛋白质漏出量为各实验组与对照组的差值，即：蛋白质漏出量(µg·mL -1)＝实验组蛋白质浓度－对照组蛋白质浓度2.2.5空气等离子体中紫外线对大肠杆菌杀灭效果影响将染菌玻片装入石英玻璃管内（该石英玻璃管为特制装备，能有效防止等离子体的活性粒子干扰，而使管内细菌只受紫外线作用[12,13]），进行空气等离子处理，并采用杀菌效果GE来表征。
2.2.6等离子体处理前后反应腔温度变化对灭菌效果的影响空气等离子放电前后分别用温度计测量反应腔内不同放电距离的温度[14]。
3. 结果与讨论3.1 低温等离子体中活性物种的分布图2所示为在低温空气等离子体中采用Langmuir双电子探针和ESR测定的电子、离子和自由基的分布状态。
从图中可以看出，同一功率下，电子、离子浓度随远程距离的增大迅速降低，在40cm后趋近于0；而自由基浓度则逐渐降低，在40cm处仍为70％。
这是因为远程等离子体场中各活性物种（电子、离子、自由基）的存活寿命不同（电子-离子再结合与自由基-自由基再结合的反应速度常数分别为10-7cm3·s-1和10-33cm6·s-1的数量级） [15,16]，沿气流方向在距放电区一定距离处可获得电子、离子与自由基的分离。
3.2 等离子体处理参数对灭菌效果的影响3.2.1 功率的影响图3所示为放电功率对杀灭效果的影响。
由图3可知，随着放电功率的增加，杀灭效果（GE值）呈波动式变化。
在距放电中心不同的远程距离，这种变化趋势是保持一致的。
在20~40W的变化区间内，GE值迅速增大，在40W处出现第一个波峰；随后，当功率增加到40W~80W时，GE值迅速减少，抵达低点波谷；当功率增加到80W~100W时，GE值又迅速增大，达到第二个波峰。
对比不同区间曲线上升和下降的速度，可以看出，当功率由40W 增加到100W时，杀灭效果变化快。
这是因为放电功率增加时（20W至40W时），定量气体分子获得的能量增大，等离子体各活性粒子密度、单位面积气体通量和平均能量增加，使得高能活性粒子与细菌的作用几率和强度增强，从而增加了对细菌的杀灭效果。
但当功率进一步增加时（40W至80W时），由于氮、氧离子质量大、流速低不能跟随电场的波动而变化，致使离子密度基本保持恒定，同时离子、电子在不断的碰撞中失去部分能量，当离子、电子密度和能量降低，不能与细菌“激烈碰撞”时，就表现为杀灭效果下降。
但这种下降不是持续的，随着功率的继续升高（当功率大于80W时），氮、氧重离子得到激发，又将获得新的能量，使得高能活性粒子与细菌的作用几率和强度增强，从而增加了对细菌的杀灭效果。
2468100246810相对浓度/%放电距离/cm灭菌效果/G E 功率/W图2 低温空气等离子体中离子与自由基相对浓度的分布 图3 放电功率对杀灭效果的影响(功率100W ，时间3min ，流量20 sccm) （空气等离子体，流量40sccm ，放电时间120s ）3.2.2 气体流量的影响从图4中可以观察到随着气体流量的增加，大肠杆菌杀灭效果呈抛物线型变化，灭菌效果先随流量增加而增大，在40sccm 处达到最大值，随后逐渐减小。
气体流量参数不仅可以强烈地影响到产生活性粒子的速度而且还反映了单位面积活性粒子通量、浓度的变化。
气体流量小会导致产生的活性粒子不足，气体流量太大又会导致过多的活性粒子来不及与细菌细胞反应就会被真空泵抽走，致使反应气体不能被充分利用。
这就解释了在20sccm 和100sccm 流量下，大肠杆菌8099杀灭效果较低的原因。
气体流量的大小不仅反映在单位面积活性粒子通量、浓度的变化上，而且也反映了活性粒子能量的大小以及气体输送速度的快慢。
当空气以40sccm 流量输送至系统时，虽然放电形成的活性自由基数量较少、但由于粒子的平均能量较高，大的动量促使大肠杆菌细胞表面被不断“涌入”的自由基连续轰击，伴随较弱的氧化作用，使得杀灭效果得到加强。
灭菌效果/G E 气体流量/sccm处理效果/G E处理时间/t图4 气体流量对大肠杆菌杀灭效果的影响 图5 放电时间对大肠杆菌杀灭效果的影响 （空气等离子体，放电功率100W ，放电时间120s ） （空气等离子体，流量40sccm ，放电功率100W ）3.2.3 放电时间的影响图5中结果表明，随着放电时间的增加，GE 值基本遵循先迅速减小后迅速增大的发展趋势，并在120s时达到最大值。
这是因为在射频等离子体中，氮离子、氧离子、原子等的高质量、低流速决定了这些粒子达到周期稳定态需要经历25~30个射频周期，而质量较小的电子在上述粒子进入稳定态之前，其行为也不断发生着波动变化。
所以，放电初始各种氧活性粒子处于非稳定态，能量很高，杀灭效果非常显著。
而后杀灭效果的下降趋势很可能是由于非稳态的离子、原子、电子碰撞或壁面化合而损失能量，同时部分高能态电子离子化为亚稳态，引起电子温度下降而造成电子扩散速率减慢，不能有效轰击细菌细胞所致。
