毛果杨全基因组硝酸根转运蛋白家族(NRT2s)序列分析

第５２卷第２期东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报Ｖｏｌ．５２Ｎｏ．２２０２４年２月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＮＯＲＴＨＥＡＳＴＦＯＲＥＳＴＲＹＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＦｅｂ．２０２４１）中央高校基本科研业务费专项资金项目（２４５２０２３０２１）㊂第一作者简介：安伟，男，２００１年２月生，西北农林科技大学林学院，本科生㊂Ｅ－ｍａｉｌ：Ａｎｗｅｉ０２１４＠１２６．ｃｏｍ㊂通信作者：张玲玲，西北农林科技大学林学院，实验师㊂Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｌ５２４＠ｓｉｎａ．ｃｎ㊂收稿日期：２０２３年８月１５日㊂责任编辑：潘㊀华㊂杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族鉴定及钾肥处理对杨树生长的影响１）安伟㊀张玲玲（西北农林科技大学，杨凌，７１２１００）㊀㊀摘㊀要㊀ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族是植物进行Ｋ＋转运的最大蛋白系统㊂以毛果杨（ＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａＴｏｒｒ．＆Ｇｒａｙ）全基因组数据为基础，利用生物信息学方法对杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族进行了全基因组鉴定，并在毛果杨全基因组中鉴定出２０个ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族成员㊂理化性质预测分析表明：ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族成员均为疏水性蛋白，等电点在５．３０ ９．１６；亚细胞定位预测显示家族成员蛋白集中在细胞质膜上㊂应用拟南芥和杨树构建系统进化树显示，ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族可分为５个亚家族㊂基因结构及基序（ｍｏｔｉｆ）分析表明，ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因进化过程相对保守㊂顺式作用元件分析表明，ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族成员含有诸多与激素㊁逆境胁迫的响应元件㊂杨树不同钾离子浓度处理下，植株的净生长情况呈现了显著的差异，说明钾元素对杨树生长影响较大㊂关键词㊀钾转运蛋白；杨树；钾分类号㊀Ｓ７１８．４６ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎＰｏｐｕｌｕｓａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｇｒｏｗｔｈｕｎｄｅｒｐｏｔａｓｓｉｕｍｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｔｒｅａｔ⁃ｍｅｎｔ／／ＡｎＷｅｉ，ＺｈａｎｇＬｉｎｇｌｉｎｇ（ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ７１２１００，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ）／／ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＦｏｒ⁃ｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０２４，５２（２）：１－８．ＴｈｅＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｓｔｈｅｌａｒｇｅｓｔｐｒｏｔｅｉｎｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｐｌａｎｔｓ．ＢａｓｅｄｏｎｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｄａｔａｏｆＰｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｏｃａｒｐａＴｏｒｒ．＆Ｇｒａｙ，ｔｈｅＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｐｏｐｌａｒｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｕｓｉｎｇｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈ⁃ｏｄｓ，ａｎｄ２０ｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｅＰ．ｔｒｉｃｏｃａｒｐａｇｅｎｏｍｅ．Ｔｈｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎｄａ⁃ｎａｌｙｓｉｓｏｆｉｔｓｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｒｅｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｔｈｅｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔｒａｎｇｉｎｇｆｒｏｍ５．３０ｔｏ９．１６．Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｏｆｔｈｅｆａｍｉｌｙａｒｅｍａｉｎｌｙｌｏｃａｔｅｄｏｎｔｈｅｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａａｎｄｐｏｐｕｌｕｓｃｏｎｓｔｒｕｃ⁃ｔｅｄａｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙｔｒｅｅ，ｗｈｉｃｈｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｃａｎｂｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ５ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ．ＧｅｎｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｍｏｔｉｆａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｈｅＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄ．Ｃｉｓ⁃ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｍｅｍｂｅｒｓｏｆｔｈｅＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｃｏｎｔａｉｎｍａｎｙｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔｓｒｅｌａｔｅｄｔｏｈｏｒｍｏｎｅｓａｎｄｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅｎｅｔｇｒｏｗｔｈｏｆｐｌａｎｔｓｓｈｏｗｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｏｔａｓｓｉｕｍｉｏｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｐｏｔａｓｓｉｕｍｈａｓａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｍｐａｃｔｏｎｐｏｐｌａｒｇｒｏｗｔｈ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｐｒｏｔｅｉｎ；Ｐｏｐｕｌｕｓ；Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ㊀㊀钾元素是植物生长发育过程中必不可少的矿质元素之一，在植物生长发育过程起着重大作用㊂钾参与植物体内许多重要的生理生化过程，如促进植物基础生理代谢㊁调节气孔运动，促进光合作用㊁维持阴阳离子平衡㊁调节渗透压等［１］，对植物整个生命周期至关重要㊂此外，钾元素在植物盐胁迫适应㊁耐干旱胁迫㊁有机酸物质长距离运输㊁氮素利用㊁糖分累积方面都发挥了重要作用［２－３］㊂钾缺乏则会导致植物老叶加速黄化，根系短小且易倒伏［４］㊂植物吸收钾离子主要依靠钾转运蛋白和钾离子通道㊂目前研究表明，参与植物体内Ｋ＋吸收及转运的蛋白或通道共有５类：ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族转运蛋白㊁ＨＫＴ家族转运蛋白㊁ＣＰＡｓ家族转运蛋白㊁Ｓｈａｋｅｒ通道和ＴＰＫ通道［５］㊂其中，ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族是一类数量众多的基因家族，广泛分布于细菌㊁真菌和植物中［６］㊂目前从拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）鉴定出１３个ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ相关家族基因［７］，水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）中２７个基因［８］，紫柳（Ｓａｌｉｘｐｕｒｐｕｒｅａ）中２２个基因［９］，玉米（Ｚｅａｍａｙｓ）２７个基因［１０］，番茄（Ｓｏ⁃ｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）１９个基因［１１］，茶树（Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ）２１个［１２］，钾转运蛋白在不同物种中有较为广泛的分布，但也存在较大的功能分异㊂ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族分为５个亚族，亚族Ⅰ主要包括拟南芥ＡｔＨＡＫ５㊁水稻ＯｓＨＡＫ５等；亚族Ⅱ主要包括拟南芥ＡｔＫＵＰ１㊁ＡｔＫＵＰ２等；亚族Ⅲ主要包括拟南芥ＡｔＫＵＰ９㊁ＡｔＫＵＰ１０等；亚族Ⅳ主要包括水稻Ｏｓ⁃ＨＡＫ４和ＯｓＨＡＫ１７；亚族Ⅴ主要包括ＡｔＫＵＰ５㊁ＡｔＫ⁃ＵＰ７等［１３］㊂亚族Ⅱ和亚族Ⅲ的成员在双子叶和单子叶植物中的分布相似，表现出很强的保守性㊂亚族Ⅰ和Ⅳ的成员则与之相反，在多种双子叶植物如拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）㊁葡萄（Ｖｉｔｉｓｖｉｎｉｆｅｒａ）㊁蒺藜苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）和单子叶植物如水稻㊁玉米和短柄草（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍｓｙｌｖａｔｉｃｕｍ）中都有所体现［１４－１６］㊂ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ转运体家族成员定位在植物不同细胞器的膜上，如质膜㊁液泡膜和类囊体膜［１７－１８］㊂同一簇的家族成员细胞定位也并不相同，因而可能发挥不同的细胞生物学功能㊂如簇Ⅱ成员ＡｔＫＵＰ４定位于液泡膜，ＯｓＨＡＫ２定位于细胞质膜，而ＯｓＨＡＫ１０定位于液泡膜等㊂在盐胁迫条件下，水稻中的高亲和性Ｋ＋转运体ＯｓＨＡＫ１㊁ＯｓＨＡＫ５和Ｏｓ⁃ＨＡＫ２１在转运Ｋ＋方面表现出不同的能力㊂这种差异不仅与它们所处的细胞位置有关，还与它们在不同组织中的表达特异性以及根细胞膜电位的变化相关㊂目前Ｋ＋转运蛋白功能研究主要集中在拟南芥㊁水稻中，杨树中的研究还有待进一步深入㊂杨树分布广泛，速生㊁抗逆性强，是我国最为重要的用材树种，西北杨２号（Ｐｏｐｕｌｕｓａｌｂａ✕Ｐ．ｔｏｍｅｎ⁃ｔｏｓａ Ｘｉｂｅｉｙａｎｇ２ ）为西北农林科技大学新培育的杨树速生优质新品种，可广泛应用于北方杨树造林㊂在杨树优质大径材培育中钾元素的缺乏是影响其速生丰产的关键因素之一㊂ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族是植物吸收和转运钾的关键蛋白家族，影响植物生长发育和抗逆能力，对杨树产量性状形成起到重要的调控作用㊂基于此，本研究以毛果杨的基因组数据库为基础，结合生物信息学方法鉴定杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因，同时对该家族成员开展理化性质分析，构建系统进化树㊁染色体定位，开展基因结构㊁保守基序分析；结合实时荧光定量ＰＣＲ方法分析杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因在不同钾肥（ＫＣｌ）浓度处理下表达情况㊂研究ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族在杨树中的分类与表达不仅可以帮助我们更好地了解这些基因在杨树生长发育调控中的功能和作用，而且可以为今后杨树改良和高效钾吸收的杨树品种筛选鉴定提供理论基础㊂１㊀材料与方法试验所用杨树材料为西北农林科技大学渭河实验站西北杨２号无性系㊂于西北农林科技大学科研温室利用水培法培养１年生扦插苗，选取长势均匀一致的扦插苗分成４组，分别使用含有０．１㊁０．５㊁１．０㊁３．０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ的Ｈｏａｇｌａｎｄ溶液浇灌，每４ｄ更换１次营养液，４５ｄ后测定各处理杨树株高㊂杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族的全基因组鉴定㊂Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ－ｎｅｘｔ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）在线数据库下载毛果杨基因组ｆａ文件，注释ｇｆｆ文件及蛋白质ｐｒｏｔｅｉｎ文件，利用ＴＢｌｏｏｌｓ工具提取杨树基因组的ＣＤＳ序列，参数设置为Ｐａｒｅｎｔ㊂从Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｘｆａｍ．ｏｒｇ／）数据库下载ＨＡＫ蛋白特征结构域Ｋ－Ｔｒａｎｓ（ＰＦ０２７０５）的隐马尔可夫模型［１９］，利用ＨＭＭＥＲ软件在比对的假阳性预期值Ｅ＜１ˑ１０－５条件下进行杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族成员初步筛选㊂将筛选得到的数据在ＣＤ－ＨＩＴ中进一步处理㊂去除重复成员㊂最后使用ＣＣＤ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｄｄ）进行蛋白结构域验证㊂杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族理化性质㊂使用ＥｘＰＡＳｙ在线网站（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）查找获得杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因的相对分子质量㊁氨基酸数量㊁不稳定系数等理化性质㊂通过ＷｏＬＦＰＳＯＲＴ网站（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ．ｈｇｃ．ｊｐ／）对杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因进行亚细胞定位预测㊂杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因系统进化树㊂在拟南芥数据库（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）获取ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族成员信息㊂利用ＣｌｕｓｔａｌＸ２对杨树和拟南芥ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ蛋白进行氨基酸多序列比对㊂使用ＭＥＧＡ１１软件运用比邻法获得最优进化模型，构建系统发育进化树，默认参数为１０００次Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ重复㊂利用ＩＴＯＬ（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｔｏｌ．ｅｍｂｌ．ｄｅ／）对进化树进行美化㊂杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族染色体定位及共线性㊂利用ＴＢｔｏｏｌｓ工具对鉴定筛选出的杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族基因进行染色体定位，并根据各基因在染色体上位置顺序的比较结果，对预测的ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因进行命名㊂利用多重共线性扫描工具包（ＭＣｓｅａｎｘ）分析杨树与簸箕柳之间共线性关系㊂杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族基因结构与保守基序㊂采用在线软件ＧＳＤＳ（ｈｔｔｐ：／／ｇｓｄｓ．ｃｂｉ．ｐｋｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／）㊁ＭＥＭＥ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｅ－ｓｕｉｔｅ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｍｅｍｅ）分别分析该家族成员基因结构和编码蛋白保守基序［２０］（基数参数为１５，其余为默认），并用ＴＢｔｏｏｌｓ进行展示㊂杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族顺式作用元件㊂提取鉴定筛选出的杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因上游２０００ｂｐ的ＣＤＳ序列提交至ＰｌａｎｔＣＡＲＥ在线网站进行顺式元件作用分析［２１］㊂１．１㊀光响应曲线测定在杨树不同Ｋ＋浓度处理１５ｄ时，于０９：００ １２：００，使用便携式光合仪ＬＩ－６４００ＸＴ（ＬＩ－ＣＯＲ，美国）采用自动可调人工光源，分别测定自然ＣＯ２摩尔分数（３８０μｍｏｌ㊃ｍｏｌ－１）下，光合有效辐射为０㊁２０㊁５０㊁１００㊁２００㊁４００㊁６００㊁８００㊁１０００㊁１２００㊁１４００㊁１６００㊁１８００μｍｏｌ／（ｍ２㊃ｓ）时杨树叶的光强－光合响应曲线㊂利用光合响应曲线分析计算光饱和时最大２㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５２卷净光合速率（Ｐｎｍａｘ）㊁暗呼吸速率（Ｒｄ）㊂１．２㊀根叶ＲＮＡ提取与反转录采集不同Ｋ＋浓度处理后１㊁５㊁１５ｄ时的叶㊁根样品，采用ＯｍｅｇａＲＮＡ提取试剂盒提取根叶的ＲＮＡ㊂采用ＥａｓｙＳｃｒｉｐｔＯｎｅ－ＳｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘ试剂盒反转录ＲＮＡ获得ｃＤＮＡ用于ｑＲＴ－ＰＣＲ㊂１．３㊀荧光定量分析使用软件ＰｒｉｍｅｒＰｒｉｍｅｒ５对杨树ＰＴＨＡＫｓ基因进行ｃＤＮＡ特异性引物设计，设计扩增产物长度１５０ ２５０ｂｐ，退火温度Ｔｍ值为５５ħ，引物信息如表１㊂以Ａｃｔｉｎ为内参基因，２ˑＳｙｂｒＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭｉｘ荧光定量试剂进行荧光定量试验㊂ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系２５μＬ，包括２ˑＳｙｂｒＧｒｅｅｎｑＰＣＲＭｉｘ１２．５μＬ㊁ｃＤ⁃ＮＡ模板１．０μＬ㊁正反向引物各０．５μＬ㊁双蒸水１０．５μＬ㊂ＰＣＲ程序：９４ħ预变性２ｍｉｎ㊁９０ħ变性２０ｓ㊁５５ħ退火２０ｓ㊁７２ħ延伸３０ｓ㊁４０个循环㊂使用２－ΔΔＣｔ法［２２］计算ＰＴＨＡＫｓ相对表达量㊂表１㊀ＰＴＨＡＫｓ实时荧光定量引物信息基因引物序列（５ －３ ）基因引物序列（５ －３ ）ＰＴＨＡＫ１－ＦＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＧＣＴＴＴＡＣＧＴＡＴＡＴＧＣＰＴＨＡＫ１１－ＦＣＴＧＣＣＧＡＣＡＣＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＰＴＨＡＫ１－ＲＴＴＡＡＧＣＡＴＡＧＧＣＡＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＰＴＨＡＫ１１－ＲＡＡＡＣＡＡＣＡＣＧＣＧＡＡＣＴＡＣＧＡＴＧＰＴＨＡＫ２－ＦＴＴＴＣＡＡＡＧＣＤＴＴＧＧＡＧＴＡＣＴＴＴＡＴＧＰＴＨＡＫ１２－ＦＡＣＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＰＴＨＡＫ２－ＲＴＧＧＧＣＡＣＧＡＧＣＡＣＴＡＴＧＧＴＡＴＰＴＨＡＫ１２－ＲＡＣＡＡＧＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴＰＴＨＡＫ３－ＦＧＴＡＧＴＧＡＴＧＴＡＧＴＣＧＴＧＣＴＴＧＴＴＧＣＴＰＴＨＡＫ１３－ＦＧＴＴＣＣＡＧＧＡＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＰＴＨＡＫ３－ＲＣＡＡＡＧＡＧＣＣＡＡＣＴＡＡＣＣＣＴＡＴＣＣＡＣＰＴＨＡＫ１３－ＲＡＧＴＣＣＴＴＣＧＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴＡＣＧＧＰＴＨＡＫ４－ＦＧＣＡＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＴＴＡＧＡＡＴＰＴＨＡＫ１４－ＦＣＣＡＡＡＴＣＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＰＴＨＡＫ４－ＲＣＡＴＣＧＡＡＧＧＡＧＴＣＧＡＴＧＡＧＧＧＰＴＨＡＫ１４－ＲＣＣＡＡＴＴＧＣＣＡＴＡＣＡＣＧＴＣＣＣＰＴＨＡＫ５－ＦＧＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＡＡＣＴＴＡＧＣＴＧＣＰＴＨＡＫ１５－ＦＧＧＴＧＣＡＡＧＧＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＡＧＡＰＴＨＡＫ５－ＲＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＣＡＡＧＣＡＡＡＣＴＡＰＴＨＡＫ１５－ＲＣＡＡＣＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＰＴＨＡＫ６－ＦＴＣＴＧＡＴＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣＡＰＴＨＡＫ１６－ＦＣＡＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＴＴＴＣＰＴＨＡＫ６－ＲＣＡＡＴＴＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＡＣＣＣＰＴＨＡＫ１６－ＲＣＴＧＴＡＡＴＧＣＡＣＡＧＡＡＣＧＣＡＡＣＣＰＴＨＡＫ７－ＦＣＴＴＧＴＣＣＴＴＧＴＴＧＧＣＡＣＴＴＧＴＡＴＧＰＴＨＡＫ１７－ＦＴＧＡＴＴＧＧＡＣＧＡＡＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＰＴＨＡＫ７－ＲＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴＧＡＣＴＡＣＡＴＣＧＣＴＡＣＴＰＴＨＡＫ１７－ＲＣＧＡＡＣＴＧＴＴＡＡＡＴＧＣＧＡＣＴＧＡＣＣＰＴＨＡＫ８－ＦＡＴＡＡＣＡＧＧＧＡＣＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＰＴＨＡＫ１８－ＦＧＧＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＰＴＨＡＫ８－ＲＧＣＴＧＡＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＧＧＡＡＡＴＡＣＰＴＨＡＫ１８－ＲＣＣＡＡＡＣＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＴＧＧＧＴＰＴＨＡＫ９－ＦＧＡＴＡＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧＧＧＡＴＴＴＰＴＨＡＫ１９－ＦＧＡＴＴＧＡＴＧＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＴＧＧＰＴＨＡＫ９－ＲＴＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＧＧＣＧＴＧＡＡＧＰＴＨＡＫ１９－ＲＧＴＴＣＡＡＴＧＣＣＡＣＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴＰＴＨＡＫ１０－ＦＣＧＧＡＧＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＴＧＴＡＧＡＴＧＧＰＴＨＡＫ２０－ＦＣＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＡＡＣＣＣＴＣＰＴＨＡＫ１０－ＲＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＧＣＰＴＨＡＫ２０－ＲＧＣＴＴＧＡＡＣＡＴＧＣＧＡＧＴＧＴＣＣＴＡＡＣＴ－ＦＣＧＧＴＧＴＧＡＴＧＧＴＴＧＧＴＡＴＡＣＴ－ＲＡＴＣＡＴＣＣＣＡＡＴＴＧＣＴＡＡＣＡ２㊀结果与分析２．１㊀杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族通过对毛果杨基因组的筛选与鉴定，共获得２０个ＰＴＨＡＫ家族成员，根据基因在染色体上的位置信息依次命名为ＰＴＨＡＫ１ ＰＴＨＡＫ２０㊂蛋白基本理化性质分析结果表明（表２）：ＰＴＨＡＫｓ长度介于６１０ ８６０个氨基酸，蛋白分子质量介于６７０６５．８８ ９５４４２．９８ｕ，平均分子质量为８６４２４．９８ｕ㊂等电点介于５．３０ ９．１６，７５％成员的等电点处于碱性区间，表明大部分ＰＴＨＡＫ蛋白含碱性氨基酸数量多㊂不稳定系数介于３２．５９ ４５．４９，其中１４个ＰＴＨＡＫｓ成员为稳定性蛋白，６个成员为不稳定性蛋白㊂所有ＰＴＨＡＫｓ蛋白成员都属于疏水性蛋白㊂根据亚细胞定位预测结果显示，ＰＴＨＡＫｓ主要位于细胞质膜上，这和ＰＴＨＡＫｓ负责钾元素转运的作用密切相关㊂２．２㊀杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ蛋白序列系统进化树将１３个拟南芥ＡｔＨＡＫｓ㊁２０个杨树ＰＴＨＡＫｓ成员蛋白序列进行多重序列比对和系统进化树构建㊂结果（图１）显示杨树２０个ＨＡＫｓ家族成员被分为５个亚家族，其中ＰＴＨＡＫ１㊁ＰＴＨＡＫ２㊁ＰＴＨＡＫ１８属于第Ⅰ家族，ＰＴＨＡＫ１７㊁ＰＴＨＡＫ１９㊁ＰＴＨＡＫ２０㊁ＰＴＨＡＫ１５分属于第Ⅱ亚家族，ＰＴＨＡＫ８㊁ＰＴＨＡＫ３㊁ＰＴＨＡＫ７分属第Ⅲ亚家族，ＰＴＨＡＫ１２㊁ＰＴＨＡＫ１０㊁ＰＴＨＡＫ１１等６个成员分属第Ⅳ亚家族，其余４个成员分属第Ⅴ亚族㊂２．３㊀杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族染色体定位及共线性杨树ＰＴＨＡＫｓ基因家族成员的染色体定位结果（图２）表明：２０个ＰＴＨＡＫｓ基因成员不均匀分布在１㊁２㊁３㊁５号等１０条毛果杨染色体上㊂其中：５号染色体上分布最多，有５个成员；３号染色体有４个成员；８㊁１０号染色体上均有２个ＰＴＨＡＫｓ成员；２㊁５㊁９㊁３第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安伟，等：杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族鉴定及钾肥处理对杨树生长的影响１２㊁１４㊁１５㊁１９号染色体均只有１个ＰＴＨＡＫ成员㊂利用簸箕柳和杨树进一步分析种间共线性关系（图３），杨树与簸箕柳构成２０对共线性关系，分别位于１㊁２㊁３㊁８㊁９㊁１０㊁１２㊁１４㊁１５㊁１９号染色体上㊂图１㊀拟南芥和杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族系统进化树２．４㊀杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族基因结构与保守基序根据基因结构分析（图４）：ＰＴＨＡＫｓ外显子数７ １０个不等，以８个居多㊂其中第Ⅳ㊁Ⅱ亚家族ＰＴＨＡＫ１１和ＰＴＨＡＫ１９具有９个外显子，ＰＴＨＡＫ１５和ＰＴＨＡＫ２０具有７个外显子；第Ⅴ亚家族ＰＴＨＡＫ５具有１０个外显子，ＰＴＨＡＫ４㊁ＰＴＨＡＫ１６㊁ＰＴＨＡＫ１３具有９个外显子㊂使用ＭＥＭＥ对ＰＴＨＡＫｓ家族保守基序分析（图５），获得１５种基序（ｍｏｔｉｆ），命名为ｍｏｔｉｆ１ ｍｏｔｉｆ１５㊂其中ＰＴＨＡＫ１２无ｍｏｔｉｆ１４㊁ｍｏｔｉｆ１５，ＰＴＨＡＫ１１无ｍｏ⁃ｔｉｆ１４，ＰＴＨＡＫ１９无ｍｏｔｉｆ１３；ＰＴＨＡＫ４无ｍｏｔｉｆ１３㊁ｍｏ⁃ｔｉｆ１，ＰＴＨＡＫ１３无ｍｏｔｉｆ１４㊁ｍｏｔｉｆ７㊁ｍｏｔｉｆ１５㊁ｍｏｔｉｆ１２㊁ｍｏｔｉｆ１１，ＰＴＨＡＫ２无ｍｏｔｉｆ１２㊁ｍｏｔｉｆ１１，其余成员均有１５种基序㊂图２㊀杨树ＰＴＨＡＫｓ基因家族染色体分布灰色区域是毛果杨与簸箕柳基因组间共线性，红色区域代表ＨＡＫｓ基因位置㊂图３㊀毛果杨与簸箕柳共线性表２㊀杨树ＰＴＨＡＫｓ成员理化性质基因ＩＤ基因名称所在染色体位置长度分子质量／ｕ等电点不稳定系数亲水性亚细胞定位Ｐｏｔｒｉ．００１Ｇ０４５２００．１ＰＴＨＡＫ１Ｃｈｒ０１：３２７８９６８３２８４０００（＋）８２１．００９１８４６．６０８．５９３２．５９０．１８质膜Ｐｏｔｒｉ．００１Ｇ０６９７９９．１ＰＴＨＡＫ２Ｃｈｒ０１：５２６４４９６５２７２１６５（＋）６８９．００７７２６９．３８８．４２３３．５００．３３质膜Ｐｏｔｒｉ．００１Ｇ１２３７００．１ＰＴＨＡＫ３Ｃｈｒ０１：１０１６１６９５１０１６７９７０（－）７９１．００８８１７３．１０７．８８３７．９００．３５质膜Ｐｏｔｒｉ．００１Ｇ２０５５００．４ＰＴＨＡＫ４Ｃｈｒ０１：２０９１４９３３２０９２２９３７（－）７７５．００８６１３６．７８５．３０３８．６８０．２１质膜Ｐｏｔｒｉ．００１Ｇ２０５５００．１ＰＴＨＡＫ５Ｃｈｒ０１：２０９１４８６５２０９２２９６７（－）８６０．００９５４４２．９８５．５６３８．４４０．２９质膜Ｐｏｔｒｉ．００２Ｇ２３７５００．３ＰＴＨＡＫ６Ｃｈｒ０２：２２９９６８８８２３００２５７５（－）８３３．００９２７３１．４４９．０６４３．７８０．５１质膜Ｐｏｔｒｉ．００３Ｇ１０９７００．１ＰＴＨＡＫ７Ｃｈｒ０３：１３２１０４９６１３２１７００１（＋）７９８．００８９６６９．６８８．６４３６．４００．３１质膜４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５２卷续（表２）基因ＩＤ基因名称所在染色体位置长度分子质量／ｕ等电点不稳定系数亲水性亚细胞定位Ｐｏｔｒｉ．００３Ｇ１０９８００．３ＰＴＨＡＫ８Ｃｈｒ０３：１３２１９７３６１３２２４４２４（＋）７９０．００８８３０２．１４６．８５３５．２９０．３９质膜Ｐｏｔｒｉ．００３Ｇ１３３９００．１ＰＴＨＡＫ９Ｃｈｒ０３：１５１９８５８３１５２０４５０１（－）７７６．００８７２０３．２８９．１６４４．４２０．３９质膜Ｐｏｔｒｉ．００３Ｇ１４８２００．１ＰＴＨＡＫ１０Ｃｈｒ０３：１６２１５２８９１６２２０６８１（－）７４６．００８３１８８．３１８．４６３６．０７０．４３质膜Ｐｏｔｒｉ．００５Ｇ０９５９００．１ＰＴＨＡＫ１１Ｃｈｒ０５：６７６９３０７６７７９６４７（＋）７２３．００８０１１８．１５８．１３４０．３７０．５５质膜Ｐｏｔｒｉ．００８Ｇ１４０８００．１ＰＴＨＡＫ１２Ｃｈｒ０８：９４９９２０４９５０４８８０（－）７６０．００８３８８２．７８７．８９４５．４９０．３３质膜Ｐｏｔｒｉ．００８Ｇ１４７３００．３ＰＴＨＡＫ１３Ｃｈｒ０８：１００３５５７０１００４１５４８（＋）６１０．００６７０６５．８８７．５２３２．８００．５７质膜Ｐｏｔｒｉ．００９Ｇ０７３５００．１ＰＴＨＡＫ１４Ｃｈｒ０９：７１９７７１６７２０３１５８（＋）７６１．００８４５５７．０５８．２９３３．９８０．４１质膜Ｐｏｔｒｉ．０１０Ｇ０９４３００．１ＰＴＨＡＫ１５Ｃｈｒ１０：１１８３７００９１１８４２９０２（－）７８０．００８７４７３．５５８．３１３６．０２０．３４质膜Ｐｏｔｒｉ．０１０Ｇ０９４４００．１ＰＴＨＡＫ１６Ｃｈｒ１０：１１８４７３６９１１８５３８０５（－）８４７．００９３６１２．９９５．９５４１．７３０．３５质膜Ｐｏｔｒｉ．０１２Ｇ０４３５０１．１ＰＴＨＡＫ１７Ｃｈｒ１２：３８９８７６８３９１５１０１（－）７８９．００８８３９５．７２８．３１３９．４８０．２５质膜Ｐｏｔｒｉ．０１４Ｇ１３２５００．１ＰＴＨＡＫ１８Ｃｈｒ１４：８８５９０８７８８６４６４０（＋）７７４．００８６８０２．３２８．４１３２．９１０．２０质膜Ｐｏｔｒｉ．０１５Ｇ０３４２００．１ＰＴＨＡＫ１９Ｃｈｒ１５：２８２１９４６２８２７８９３（－）７９０．００８８７８４．４８８．６０３７．０３０．２６质膜Ｐｏｔｒｉ．０１９Ｇ０５６５００．１０ＰＴＨＡＫ２０Ｃｈｒ１９：９５１９１７３９５２６６８２（－）７９３．００８７８４３．３２６．７３４０．３５０．３９质膜图４㊀ＰＴＨＡＫｓ基因结构２．５杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族顺式作用元件获取杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族启动子上游２０００ｂｐ区域，分析启动子区域发现杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族均存在ＴＡＴＡ－ｂｏｘ㊁ＣＡＡＴ－ｂｏｘ㊁厌氧诱导㊁光信号响应的顺式元件㊂此外，８０％的成员包含赤霉素响应元件，７０％的成员有脱落酸响应元件，７５％的成员包含干旱诱导的ＭＹＢ结合元件，４５％的成员包含生长素响应等元件（图６）㊂２．６㊀杨树植株高生长测定为了探究Ｋ＋对杨树生长的影响，使用不同钾素浓度处理西北杨２号无性系，测定植株高生长状况㊂表３中记录了在０．１㊁０．５㊁１．０㊁３．０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ处理下杨树的净生长数据，４个浓度钾素处理下树高生长斜率分别是２．０４㊁２．８２㊁３．０３㊁２．９１，表明Ｋ＋是影响杨树生长的限制因素㊂缺钾（０．１ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ）条件下，杨树的生长显著低于正常和高钾处理，表明钾素合理施用能够有效提高杨树的高生长㊂图５㊀ＰＴＨＡＫｓ保守基序表３㊀不同钾素浓度时杨树净生长值检测次数杨树净生长值／ｃｍ０．１ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ０．５ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ１．０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ３．０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ１０㊀㊀㊀㊀０㊀㊀㊀㊀０㊀㊀㊀㊀０㊀㊀㊀㊀２（２．８３ʃ０．３１）Ｂｅ（２．８８ʃ１．３３）Ｂｅ（６．２０ʃ２．４４）Ａｅ（４．５３ʃ０．７０）ＡＢｆ３（４．５７ʃ０．６７）Ａｄｅ（６．００ʃ２．３５）ＡＢｄ（９．００ʃ３．３０）Ａｄｅ（７．４０ʃ１．２５）ＡＢｅ４（６．４７ʃ０．９６）Ａｄ（７．６５ʃ１．４４）ＡＢｄ（１１．３７ʃ３．９３）Ａｃｄｅ（９．１０ʃ１．００）ＡＢｅ５（７．７０ʃ０．７９）Ｂｃｄ（１０．５０ʃ１．９４）ＡＢｃ（１４．０３ʃ３．４５）Ａｃｄ（１２．０３ʃ１．２７）Ａｄ６（１０．５７ʃ１．５９）Ｂｂｃ（１３．７３ʃ１．５０）ＡＢｃ（１６．７３ʃ２．６６）Ａｂｃ（１４．８７ʃ１．５０）Ａｃ７（１２．６７ʃ２．４９）Ｂａｂ（１７．１７ʃ１．４２）Ａｂ（２０．２７ʃ２．９５）Ａａｂ（１８．４７ʃ２．００）Ａｂ８（１４．７３ʃ３．５０）Ｂａ（１９．９３ʃ０．２２）Ａａ（２２．６０ʃ２．１８）Ａａ（２１．３０ʃ１．５１）Ａａ斜率ｋ值２．０４２．８２３．０３２．９１㊀㊀注：表中记录８次测定数据，每５ｄ测定１次，第１次净生长计为０；数据为平均值ʃ标准差（ｎ＝３）；试验为３次重复取平均值结果；同行不同大写字母表示同一时间不同钾素处理差异显著（Ｐ＜０．０５）；同列不同小写字母表示同一钾素处理不同时间差异显著（Ｐ＜０．０５）㊂２．７㊀光响应曲线由图７可知４个不同钾素浓度处理下，净光合速率随光合有效辐射增加的变化趋势是相似的，在５第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安伟，等：杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族鉴定及钾肥处理对杨树生长的影响光合有效辐射（ＲＰＡ）为０ １０００μｍｏｌ／（ｍ２㊃ｓ），净光合速率（Ｐｎ）随ＲＰＡ增加而快速增加，在１０００μｍｏｌ／（ｍ２㊃ｓ）以上，净光合速率增长趋于平缓㊂１．０和３．０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ处理下，净光合速率最大值高于其他处理，说明不同Ｋ＋浓度处理对植物的光合作用有重大影响㊂图６㊀ＰＴＨＡＫｓ成员启动子区顺式元件种类２．８㊀ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因相对表达通过对杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族表达模式分析（图８）发现，在叶片中ＰＴＨＡＫ３㊁ＰＴＨＡＫ１５在所有钾浓度处理中都有相对较高的表达丰度㊂ＰＴＨＡＫ１０㊁ＰＴＨＡＫ１３㊁ＰＴＨＡＫ１９在低钾（０．１㊁０．５ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ）处理下出现相对较高表达情况㊂ＰＴＨＡＫ５㊁ＰＴＨＡＫ６㊁ＰＴＨＡＫ７则是在高浓度钾（１．０㊁３．０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ）处理中有相对较高丰度表达㊂在根系组织中ＰＴＨＡＫ３㊁ＰＴＨＡＫ６㊁ＰＴＨＡＫ１５在所有钾浓度中均有较高的表达丰度㊂ＰＴＨＡＫ３㊁ＰＴＨＡＫ５㊁ＰＴＨＡＫ７㊁ＰＴＨＡＫ１３㊁ＰＴＨＡＫ１９等成员在低钾胁迫下相对表达量最高㊂ＰＴＨＡＫ６㊁ＰＴＨＡＫ５㊁ＰＴＨＡＫ７㊁ＰＴＨＡＫ１２㊁ＰＴＨＡＫ１５则是在高浓度钾（１．０㊁３．０ｍｍｏｌ／ＬＫＣｌ）处理中存在较高丰度表达㊂以上结果表明不同ＰＴＨＡＫｓ家族成员在叶片和根系中的响应存在表达特异性㊂图７㊀杨树４种钾浓度处理光响应特征６㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５２卷图８㊀杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族成员不同钾素浓度处理下表达模式３　讨论与结论杨树生长速度快，材积产出高，抗逆性较强是我国重要的防护林和工业用材林㊂培育大径级杨树是目前我国杨树生产的重要目标㊂钾元素是植物生长发育过程中必不可少的矿质元素，能够促进植物基础生理代谢，促进光合作用，增强植物逆境抗性等，对杨树大径级材生产起着关键作用㊂开展杨树钾响应以及钾转运调控研究对今后杨树开展丰产栽培㊁杨树遗传改良具有重要意义㊂本研究从毛果杨全基因组数据为基础，利用生物信息学方法对杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族进行了全基因组学鉴定与生物信息学分析，同时以国审新品种西北杨２号为材料分析了杨树对钾素的生长响应㊂研究在毛果杨全基因组中鉴定出来２０个ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族成员㊂预测分析其理化性质发现，ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因蛋白序列长度在６１０ ８６０个氨基酸，平均蛋白序列长度为７７５个氨基酸；等电点在５．３０ ９．１６，７５％成员都属于碱性蛋白；亲水性显示该家族成员都为疏水性蛋白；预测亚细胞定位集中在细胞质膜上，研究结果印证家族基因钾转运蛋白基本特征㊂构建拟南芥和杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族的系统进化树，通过分析可知和拟南芥不同，杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族可分为５个亚家族，这与多数ＨＡＫ家族被划分为５个系统进化簇类似㊂基因结构及ｍｏｔｉｆ的分析表明，ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因进化过程相对保守，几乎所有成员都包含ｍｏｔｉｆ１－ｍｏ⁃ｔｉｆ１５，这与前人的研究结果一致［２３］㊂顺式作用元件分析结果显示，ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族成员含有许多与激素㊁逆境胁迫的响应元件，表明其还可能受到环境胁迫以及植物激素的调控与响应［２４］㊂设置了０．１㊁０．５㊁１．０㊁３．０ｍｍｏｌ／Ｌ４个钾肥（ＫＣｌ）施用浓度处理来分析杨树的生长情况㊂在对杨树扦插苗净生长测定分析发现，低钾浓度处理显著抑制了杨树无性苗的高生长，说明钾元素直接影响杨树的高生长；同时对不同钾素浓度处理的杨树进行了光响应测定，分析可知在正常（１．０ｍｍｏｌ／Ｌ）和高钾（３．０ｍｍｏｌ／Ｌ）处理下，净光合速率最大值均高于低钾处理，说明不同Ｋ＋浓度处理对杨树的光合作用有重大影响，而提高光合速率是实现杨树大径材培育的重要方式㊂使用实时荧光定量技术检测部分ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族基因在杨树根和叶中的表达情况㊂研究表明在低钾胁迫下ＰＴＨＡＫ１０㊁ＰＴＨＡＫ１３㊁ＰＴＨＡＫ１５等成员在叶片中有较高表达；ＰＴＨＡＫ５㊁ＰＴＨＡＫ６㊁ＰＴＨＡＫ７等成员在根系中有较高表达㊂在拟南芥的研究发现，缺钾可以诱导ＡｔＨＡＫ５的表达，在钾离子浓度小于５０μｍｏｌ㊃Ｌ－１时ＡｔＨＡＫ５突变体种子萌发缓慢，根生长受抑制，钾离子吸收能力降低［２５］㊂另外在拟南芥中发现ＡｔＫＵＰ４在根尖表达，通过改变生长素运输来影响根尖的生长［２６］㊂同样在水稻中ＯｓＨＡＫ５受缺钾和干旱胁迫诱导［２７］㊂马铃薯在低钾胁迫下，多数ＨＡＫ基因表达量呈上调［２８］，表明马铃薯ＨＡＫ基因具有低钾响应特征，可能和低钾环境下７第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安伟，等：杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族鉴定及钾肥处理对杨树生长的影响钾素高效转运相关㊂杨树中多个低钾高表达基因可能在杨树低钾条件下钾素的高效转运相关㊂另外，本研究中使用不同浓度ＫＣｌ溶液进行钾元素含量的控制，不能忽略的是随着Ｋ＋浓度的改变，Ｃｌ－浓度也随之变化㊂氯作为植物生长必须的营养元素，Ｃｌ－也是细胞维持渗透压的主要离子，对细胞延长，维持细胞液缓冲体系㊁水分平衡㊁提高植物抗旱性具有重要意义［２９］，而具体Ｃｌ－的作用还有待今后深入探讨㊂本研究在毛果杨全基因组中鉴定出２０个ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ家族成员㊂随后对家族成员进行理化性质与亚细胞定位预测分析，构建系统进化树，开展了顺式作用元件分析，最后对４个Ｋ＋浓度处理杨树扦插苗的净生长与组织基因表达进行分析㊂研究为更好地了解杨树ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰ基因家族的功能提供了前期基础，同时也为研究和选育高效钾吸收的杨树品种提供了参考信息㊂参㊀考㊀文㊀献［１］㊀ＷＡＮＧＹ，ＷＵＷＨ．ＰｌａｎｔｓｅｎｓｉｎｇａｎｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏＫ＋ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔ，２０１０，３（２）：２８０－２８７．［２］㊀ＷＡＮＧＹ，ＷＵＷＨ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｏｔａｓｓｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｓｉｇｎａ⁃ｌｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２０１７，３９：１２３－１２８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｂｉ．２０１７．０６．００６．［３］㊀柴薇薇，王文颖，崔彦农，等．植物钾转运蛋白ＫＵＰ／ＨＡＫ／ＫＴ家族研究进展［Ｊ］．植物生理学报，２０１９，５５（１２）：１７４７－１７６１．［４］㊀谭志新，谢留伟，李洪戈，等．基于ＡＨＰ－隶属函数法的棉花子叶期耐低钾能力鉴定［Ｊ／ＯＬ］．作物学报．［２０２３－０７－２４］．ｈｔ⁃ｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／１１．１８０９．Ｓ．２０２３０７２１．１７２３．００６．ｈｔｍｌ．［５］㊀ＷＡＮＧＹ，ＷＵＷＨ．Ｐｏｔａｓｓｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｓｉｇｎａｌｉｎｇｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２０１３，６４：４５１－４７６．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ－ａｒｐｌａｎｔ－０５０３１２－１２０１５．［６］㊀吴胜男，杨媛，李英壮，等．小麦ＫＵＰ／ＨＡＫ／ＫＴ基因家族的全基因组鉴定㊁系统进化和表达模式分析［Ｊ］．西北农业学报，２０２１，３０（３）：３５１－３６４．［７］㊀ＱＵＩＮＴＥＲＯＦＪ，ＢＬＡＴＴＭＲ．ＡｎｅｗｆａｍｉｌｙｏｆＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｆｒｏｍＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｔａｒｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｃｒｏｓｓｐｈｙｌａ［Ｊ］．ＦＥＢＳＬｅｔ⁃ｔｅｒｓ，２０１３，４１５（２）：２０６－２１１．［８］㊀ＹＡＮＧＺＦ，ＧＡＯＱＳ，ＳＵＮＣＳ，ｅｔａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｏｆＨＡＫｐｏｔａｓｓｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｒｉｃｅ（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＧｅｎｏｍｉｃｓ，２００９，３６（３）：１６１－１７２．［９］㊀ＬＩＡＮＧＭＸ，ＧＡＯＹＣ，ＭＡＯＴＴ，ｅｔａｌ．ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｉｎｗｉｌｌｏｗｕｎ⁃ｄｅｒｐｏｔａｓｓｉｕｍｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｄｒｏｕｇｈｔ，ａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．ＢｉｏＭｅ⁃ｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，２０２０：１－１２．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０２０／２６９０７６０．［１０］㊀ＺＨＡＮＧＺＢ，ＺＨＡＮＧＪＷ，ＣＨＥＮＹＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅａ⁃ｎａｌｙｓｉｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＨＡＫｐｏｔａｓｓｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｆａｍｉ⁃ｌｙｉｎｍａｉｚｅ（ＺｅａｍａｙｓＬ．）［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓ，２０１２，３９（８）：８４６５－８４７３．［１１］㊀ＨＹＵＮＴＫ，ＹＥＯＮＧＧＩＬＲ，ＥＫＹＵＮＥＫ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎａｌｙｓｅｓｏｆｔｈｅＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｆａｍｉｌｙｉｎｔｏｍａｔｏ（ＳｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍＬ．）［Ｊ］．ＧｅｎｅｓＧｅｎｏｍｉｃｓ，２０１４，３６（３）：３６５－３７４．［１２］㊀ＹＡＮＧＴＹ，ＬＵＸ，ＷＡＮＧＹ，ｅｔａｌ．ＨＡＫ／ＫＵＰ／ＫＴｆａｍｉｌｙｐｏ⁃ｔａｓｓｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｓａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｏｔａｓｓｉｕｍｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｔｅａｐｌａｎｔｓ（ＣａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓＬ．）：ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓ［Ｊ］．ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓ，２０２０，２１（１）：１－１８．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８６４－０２０－０６９４８－６．［１３］㊀ＮＩＥＶＥＳＣＭ，ＣＨＡＶＡＮＩＥＵＡ，ＪＥＡＮＧＵＥＮＩＮＬ，ｅｔａｌ．ＤｉｓｔｉｎｃｔａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｔｈｅＣ－ＬｉｎｋｅｒｄｏｍａｉｎｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＫ＋ｃｈａｎ⁃ｎｅｌＫＡＴ２ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｉｔｓｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙａｔｔｈｅｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１４，１６４：１４１５－１４２９．ｄｏｉ：１０．１１０４／ｐｐ．１１３．２２９７５７．［１４］㊀ＭＡＮＵＥＬＮＣ，ＲＥＹＥＳＲ，ＡＬＡＩＮＣ，ｅｔａｌ．ＵｎｅｖｅｎＨＡＫ／ＫＵＰ／ＫＴｐｒｏｔｅｉｎｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｍｏｎｇａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ：ｓｐｅｃｉｅｓｄｉｓｔｒｉｂｕ⁃ｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２０１６，７：１２７－１３４．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｐｌｓ．２０１６．００１２７．［１５］㊀ＡＮＮＥＡＶ，ＭＡＮＵＥＬＮＣ，ＭＥＲＩＥＭＤ，ｅｔａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏ⁃ｇｙｏｆＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｃｒｏｓｓｔｈｅｐｌａｎｔｃｅｌｌｍｅｍｂｒａｎｅ：ｗｈａｔｄｏｗｅｌｅａｒｎｆｒｏｍｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｂｅｔｗｅｅｎｐｌａｎｔｓｐｅｃｉｅｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１４，１７１（９）：７４８－７６９．［１６］㊀段慧荣，周学辉，胡静，等．高等植物Ｋ＋吸收及转运的分子机制研究进展［Ｊ］．草业学报，２０１９，２８（９）：１７４－１９１．［１７］㊀ＬＩＷＨ，ＸＵＧＨ，ＡＢＤＥＬＡ，ｅｔａｌ．ＰｌａｎｔＨＡＫ／ＫＵＰ／ＫＴＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌ＆Ｄｅ⁃ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，２０１８，７４：１３３－１４１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｅｍｃｄｂ．２０１７．０７．００９．［１８］㊀李学文，游西龙，王艳．钾离子转运载体ＨＡＫ／ＫＵＰ／ＫＴ家族参与植物耐盐性的研究进展［Ｊ］．植物科学学报，２０１９，３７（１）：１０１－１０８．［１９］㊀ＧＵＰＴＡＭ，ＱＩＵＸＨ，ＷＡＮＧＬ，ｅｔａｌ．ＫＴ㊁ＨＡＫ㊁ＫＵＰｐｏｔａｓｓｉ⁃ｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｎｄｔｈｅｉｒｗｈｏｌｅ⁃ｌｉｆｅｃｙｃｌｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｉｎｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ）［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓＧｅｎｏｍｉｃｓ，２００８，２８０（５）：４３７－４５２．［２０］㊀ＪＩＮＲ，ＪＩＡＮＧＷ，ＹＡＮＭＸ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ⁃ｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＨＡＫＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｆａｍｉｌｙｉｎＩｐｏ⁃ｍｏｅａ［Ｊ］．Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０２１，１１：１－１８．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１３２０５－０２０－０２５５２－３．［２１］㊀梅玉琴，刘意，王崇，等．甘薯ＰＨＢ基因家族的全基因组鉴定和表达分析［Ｊ］．作物学报，２０２３，４９（６）：１７１５－１７２５．［２２］㊀ＭÄＳＥＲＰ，ＴＨＯＭＩＮＥＳ，ＳＣＨＲＯＥＤＥＲＪＩ，ｅｔａｌ．ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｗｉｔｈｉｎｃａｔｉｏｎｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｆａｍｉｌｉｅｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００１，１２６（４）：１６４６－１６６７．［２３］㊀代书桃，朱灿灿，马小倩，等．谷子ＨＡＫ／ＫＵＰ／ＫＴ钾转运蛋白家族全基因组鉴定及其对低钾和高盐胁迫的响应［Ｊ］．作物学报，２０２３，４９（８）：２１０５－２１２１．［２４］㊀赵建荣，杨圆，秦改花，等．石榴ＨＡＫ／ＫＵＰ／ＫＴ家族基因鉴定及钾转运功能分析［Ｊ］．园艺学报，２０２２，４９（４）：７５８－７６８．［２５］㊀ＹＯＵＮＧＪＰ，ＭＡＲＫＵＳＧ，ＪＵＬＩＡＮＩ，ｅｔａｌ．Ｈｉｇｈ⁃ａｆｆｉｎｉｔｙＫ＋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ：ａｔｈａｋ５ａｎｄａｋｔ１ａｒｅｖｉｔａｌｆｏｒｓｅｅｄｌｉｎｇｅｓ⁃ｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｐｏｓｔｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｇｒｏｗｔｈｕｎｄｅｒｌｏｗ⁃ｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｏｎ⁃ｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１５３（２）：８６３－８７５．［２６］㊀ＴＥＭＰＬＡＬＥＸＩＳＤ，ＴＳＩＴＳＥＫＩＡＮＤ，ＬＩＵＣ，ｅｔａｌ．ＰｏｔａｓｓｉｕｍｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＴＲＨ１／ＫＵＰ４ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｄｉｓｔｉｎｃｔａｕｘｉｎ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｒｏｏｔｓｙｓｔｅｍａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０２１，１８８（２）：１０４３－１０６０．［２７］㊀杨天元．水稻高亲和钾离子转运蛋白基因ＯｓＨＡＫ５的功能研究［Ｄ］．南京：南京农业大学，２０１７．［２８］㊀许赛赛，张博，仲阳，等．马铃薯ＨＡＫ／ＫＵＰ／ＫＴ基因家族鉴定与表达分析［Ｊ］．分子植物育种，２０２１，１９（１２）：３８７８－３８８６．［２９］㊀ＲＡＶＥＮＪＡ．Ｃｈｌｏｒｉｄｅ：ｅｓｓｅｎｔｉａｌｍｉｃｒｏｎｕｔｒｉｅｎｔａｎｄｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎ⁃ａｌｂｅｎｅｆｉｃｉａｌｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａｎｙ，２０１７，６８（３）：３５９－３６７．８㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀东㊀北㊀林㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５２卷。

毛果杨PP2C基因家族生物信息学分析摘要：蛋白磷酸酯酶2C(PP2C)是蛋白磷酸酯酶中的一大类,广泛参与逆境信号的传递过程。

本实验采用比较基因组学的方法，利用已知的拟南芥PP2C蛋白序列为检索序列，在全基因组水平上搜索毛果杨的PP2C基因的同源序列。

最终确定了毛果杨45个PP2C候选基因。

对同源序列作进一步的多序列联配、ESTs、MEME和系统发生表达分析。

关键词：毛果杨比较基因组学基因家族Abstract: Protein phosphatase 2C (PP2C) is a protein phosphatase in a large class, the broad participation of adversity signal transmission process. In this study, we searched the homologous sequence from Populus trichocarpa protein database based on the complete genome by using comparative genomics methods and taking the Arabidopsis thaliana PP2C protein which has been isolated as the retrieval sequence. The results showed that 45 PP2C-like protein were identified from Populus trichocarpa. Further, we also analyzed the sequence alignment, MEME, EST and phylogenetic.Keywords: Populus trichocarpa comparative genomics genne family真核生物基因组中，编码蛋白磷脂酶的基因远远少于蛋白激酶，一般只有蛋白激酶基因数的四分之一至三分之一。

山西农业科学 2023，51（8）：852-860Journal of Shanxi Agricultural Sciences毛果杨多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白家族PtPGIP 的生物信息学分析刘海静，田星，王露，宫海丰，殷涵，刘浩宁，包玉英（内蒙古大学 牧草与特色作物生物学教育部重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010020）摘要：植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase -inhibiting protein ，PGIP ）可特异性识别病原菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶，从而抑制病原菌对植物细胞壁重要成分——果胶的降解，以增强植物病原菌抗性。

为探明模式树种杨树PGIP 抗病机制，对毛果杨PGIP （PtPGIP ）家族成员进行鉴定，以及对蛋白质理化性质和结构、系统进化、基因表达模式进行分析。

结果表明，毛果杨基因组中鉴定到4个PtPGIP 基因，其中，PtPGIP1和PtPGI2位于6号染色体串联重复，PtPGIP3和PtPGIP4位于16号染色体串联重复；PtPGIP1是假基因，PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4具有完整的PGIP 蛋白结构域。

PtPGIP 均为疏水蛋白，具有良好的脂溶性，且具有3~7个N -糖基化位点。

亚细胞定位预测表明，其可能定位于细胞外。

除PtPGIP1以外，PtPGIP2、PtPGIP3、PtPGIP4蛋白均包含10个LRR 片段，LRR 中的保守序列xxLxLxx 及蛋白质分子对接均表现出差异性。

PtPGIP 基因的表达具有组织特异性，PtPGIP1基因在各个组织部位的表达水平均较低，PtPGIP2和PtPGIP4基因在根、幼苗、花序中的表达量高于叶片，尤其是PtPGIP2基因在花序中的表达量最高，说明毛果杨PGIP 基因家族发生了功能分化，使其在应对多种逆境胁迫中发挥重要作用。

关键词：毛果杨；多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白；基因序列；表达模式；蛋白结构中图分类号：S792.11 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）08‒0852‒09Bioinformatics Analysis of Polygalacturonase-Inhibitor ProteinFamily PtPGIP in Populus trichocarpaLIU Haijing ，TIAN Xing ，WANG Lu ，GONG Haifeng ，YIN Han ，LIU Haoning ，BAO Yuying（Key Laboratory of Herbage and Endemic Crop Biology ，Ministry of Education ，Inner Mongolia University ，Hohhot 010020，China ）Abstract ：Polygalacturonases inhibiting proteins(PGIPs) are produced by plants to specifically recognize pathogen -secreted polygalacturonases, further inhibiting degradation of pectin, an important component of plant cell wall by pathogen, which enhances the resistance to plant pathogens. To explore the disease resistance mechanism of PGIP in a model tree species of Poplar, in this study, the members of PGIP(PtPGIP) family in Populus trichocarpa were identified, physical and chemical properties and structure of proteins, phylogeny,and gene expression patterns of PGIP(PtPGIP) family in Populus trichocarpa were analyzed. The results showed that four PtPGIP genes were identified in the Populus trichocarpa . PtPGIP1 and PtPGI2 were tandem duplications and located on Chr. 6, PtPGIP3 and PtPGIP4 were tandem duplications and located on Chr.16, PtPGIP1 was a pseudogen, and PtPGIP2, PtPGIP3, and PtPGIP4 possessed a complete PGIP protein domain. All PtPGIPs were hydrophobic proteins, had good lipophilicity and 3 to 7 N -glycosylation sites. Subcellular localization prediction indicated that they were probably located outside the cell. PtPGIP2, PtPGIP3, and PtPGIP4 contained 10 LRR fragments except for the PtPGIP1. The conserved sequence xxLxLxx in LRR as well as protein molecular docking showed differences. PtPGIP genes revealed tissue -specific expression. The expression levels of PtPGIP1 were low in various tissues. While the expression levels of PtPGIP2 and PtPGIP4 in roots, seedlings, and inflorescences were higher than those in leaves, especially the expression level of PtPGIP2 was the highest in inflorescences, indicating that the PGIP gene family of Populus trichocarpa had undergone functional differentiation, which made it play an important role in coping with various adversity stresses.Key words ：Populus trichocarpa ; polygalacturonase -inhibitor protein; gene sequence; expression pattern; protein structuredoidoi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.08.03收稿日期：2022-11-25基金项目：内蒙古自治区高等学校科学研究项目（NJZY19009）；内蒙古大学引进高层次人才科研启动基金项目（21400-5175163）作者简介：刘海静（1986-），女，河北承德人，讲师，博士，主要从事植物基因家族进化研究工作。

櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 残留情况分析［Ｊ］．现代农业科技，２０１２（３）：２１２－２１３．［５０］闫革彬，金文军．北京市昌平区蔬菜中农药残留状况分析［Ｊ］．中国食品卫生杂志，２００８，２０（３）：２５５－２５７．［５１］武丕武，侯润兰，王丽英．２００８年山西蔬菜中农药残留问题分析［Ｊ］．中国植保导刊，２００９，２９（６）：３８－４０．［５２］李树才，姚明辉．农药管理使用与农产品质量安全［Ｃ］／／２０１４年中国植物保护学会学术年会．厦门，２０１４：２４６－２５０．［５３］罗　鹏．蔬菜生产中农药使用现状、存在问题及对策研究［Ｊ］．乡村科技，２０１６（２４）：７４．［５４］江苏省市场监督管理局．江苏省市场监督管理局官网数据［ＥＢ／ＯＬ］．（２０２２－０６－０１）［２０２２－０６－０２］．ｈｔｔｐ：／／ｓｃｊｇｊ．ｊｉａｎｇｓｕ．ｇｏｖ．ｃｎ／．［５５］王琅 ．对农药包装废弃物回收处理的思考［Ｊ］．果农之友，２０２１（１２）：６３－６５．［５６］李宏秋．蔬菜农药残留现状及治理对策［Ｊ］．现代食品，２０２１（１４）：１２４－１２６．［５７］曹爱兵，姚　瑶，陈长军．江苏省绿色优质农产品基地在农药准入下的病害防控［Ｊ］．江苏农业科学，２０２２，５０（３）：１２５－１３０．［５８］曹爱兵，姚　瑶．江苏省农业绿色发展进阶思考与政策取向探讨［Ｊ］．农产品质量与安全，２０２１（２）：１４－１７．［５９］陆仲斐．２０１７年—２０２１年上海市叶菜类蔬菜中农药残留检测与分析［Ｊ］．上海农业科技，２０２２（３）：２７－３０．［６０］陈　海．蔬菜农药残留超标的原因及防治对策［Ｊ］．现代农村科技，２０２２（１）：１１１－１１２．［６１］张　妍．我国蔬菜农药残留形成原因及控制对策［Ｊ］．农业科技与信息，２０１９，１６（１９）：８０－８１．［６２］王志伟，李　洋．蔬菜中农药的使用对食品安全问题的影响［Ｊ］．现代食品，２０１７（１５）：１－４．［６３］曾永才．水稻病虫害防治与农药使用安全探讨［Ｊ］．世界热带农业信息，２０２３（３）：４４－４５．［６４］陈慧贞．蔬菜农药残留超标原因与控制策略［Ｊ］．食品安全导刊，２０２１（３０）：１４５－１４５，１４７．［６５］施　阳，王春昕，朱丽花，等．镇江新区蔬菜农产品质量安全监管现状及对策建议［Ｊ］．长江蔬菜，２０２０（１７）：３－５．［６６］陈长福．浅谈农药安全使用存在的问题及其对策［Ｊ］．南方农业，２０１７，１１（１９）：８５－８６，８９．毕田田，张　骐，代金玲，等．毛果杨ＰｔＩＰＴ５基因的克隆及低温胁迫表达分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（２２）：１４－２３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．２２．００３毛果杨ＰｔＩＰＴ５基因的克隆及低温胁迫表达分析毕田田１，张　骐１，代金玲１，高秀芳２，白玉娥１（１．内蒙古农业大学林学院，内蒙古呼和浩特０１００００；２．鄂尔多斯市林业和草原事业发展中心，内蒙古鄂尔多斯０１７０００） 摘要：为探究异戊稀基转移酶基因（ＩＰＴ）的抗逆机理，通过ＰＣＲ技术从毛果杨叶片中克隆了ＩＰＴ基因，命名为ＰｔＩＰＴ５，对该基因及其蛋白进行生物信息学分析，并使用实时荧光定量技术（ｑＲＴ－ＰＣＲ）分析其在毛果杨组培苗不同组织及不同程度低温处理下的表达特性。

江苏农业学报(ＪｉａｎｇｓｕＪ.ｏｆＡｇｒ.Ｓｃｉ.)ꎬ２０２１ꎬ３７(４):９５７￣９６７ｈｔｔｐ://ｊｓｎｙｘｂ.ｊａａｓ.ａｃ.ｃｎ孙㊀宇ꎬ刘志鑫ꎬ叶㊀子ꎬ等.杧果ＲＡＶ基因家族的全基因组分析[Ｊ].江苏农业学报ꎬ２０２１ꎬ３７(４):９５７￣９６７.ｄｏｉ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１０００￣４４４０.２０２１.０４.０１９杧果ＲＡＶ基因家族的全基因组分析孙㊀宇１ꎬ２ꎬ㊀刘志鑫２ꎬ㊀叶㊀子１ꎬ２ꎬ㊀罗睿雄３ꎬ㊀刘晓妹１ꎬ２ꎬ㊀蒲金基１ꎬ２ꎬ㊀张㊀贺１ꎬ２(１.海南大学植物保护学院ꎬ海南海口５７０２２８ꎻ２.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室ꎬ海南海口５７１１０１ꎻ３.中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所ꎬ海南海口５７１１０１)收稿日期:２０２０￣１１￣２５基金项目:国家重点研发专项(２０１９ＹＦＤ１０００５０４)ꎻ中国热带农业科学院基本科研业务费专项(１６３００４２０１７０１９)作者简介:孙㊀宇(１９９５－)ꎬ男ꎬ海南三亚人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向为植物保护ꎮ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｓｕｎｙｕｑｐ＠ｑｑ.ｃｏｍ通讯作者:张㊀贺ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ａｔｚｚｈｅｆ＠１６３.ｃｏｍꎻ蒲金基ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｃａｔａ￣ｓｐｊｊ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀摘要:㊀为了揭示ＲＡＶ家族基因在杧果中的序列特征及其表达特性ꎬ采用生物信息学方法对杧果ＲＡＶ家族基因进行序列分析ꎬ并通过ｑＲＴ￣ＰＣＲ技术研究杧果胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染过程中该家族基因的相对表达量ꎮ结果表明ꎬ从杧果基因组中鉴定出６个ＲＡＶ基因家族成员ꎬ其编码的蛋白质均具有ＡＰ２和Ｂ３超家族保守域结构ꎬ命名为ＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６ꎮＭｉＲＡＶ１和ＭｉＲＡＶ５为不稳定亲水碱性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ２和ＭｉＲＡＶ３为不稳定亲水酸性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ４为稳定亲水酸性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ６为稳定亲水碱性蛋白质ꎮ杧果ＲＡＶ基因编码的蛋白质主要定位于细胞核中ꎬ无规则卷曲和α￣螺旋是６个ＭｉＲＡＶｓ蛋白二级结构的主要元件ꎮ系统进化树结合基序分析结果表明ꎬ在杧果与拟南芥㊁烟草㊁苹果㊁菠萝和毛果杨中ꎬＲＡＶ家族基因具有多样性ꎬ在进化上结构具有保守性ꎮｑＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬ胶孢炭疽菌侵染过程中ꎬ杧果ＲＡＶ基因的相对表达量均显著下调ꎻ细菌性黑斑病菌侵染过程中ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６的相对表达量在３ｈ时均显著下调ꎬＭｉＲＡＶ１㊁ＭｉＲＡＶ２㊁ＭｉＲＡＶ３和ＭｉＲＡＶ６的相对表达量在６ｈ时均显著上调ꎬＭｉＲＡＶ１㊁ＭｉＲＡＶ５和ＭｉＲＡＶ６的相对表达量分别在１２ｈ㊁２４ｈ㊁４８ｈ㊁７２ｈ时均显著上调ꎮ以上发现将为研究杧果ＲＡＶ基因家族成员的功能和作用机制奠定基础ꎮ关键词:㊀杧果ꎻＲＡＶ基因家族ꎻ全基因组鉴定ꎻ表达分析中图分类号:㊀Ｓ６６７.７㊀㊀㊀文献标识码:㊀Ａ㊀㊀㊀文章编号:㊀１０００￣４４４０(２０２１)０４￣０９５７￣１１Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＲＡＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｍａｎｇｏＳＵＮＹｕ１ꎬ２ꎬ㊀ＬＩＵＺｈｉ￣ｘｉｎ２ꎬ㊀ＹＥＺｉ１ꎬ２ꎬ㊀ＬＵＯＲｕｉ￣ｘｉｏｎｇ３ꎬ㊀ＬＩＵＸｉａｏ￣ｍｅｉ１ꎬ２ꎬ㊀ＰＵＪｉｎ￣ｊｉ１ꎬ２ꎬ㊀ＺＨＡＮＧＨｅ１ꎬ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＨａｉｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＨａｉｋｏｕ５７０２２８ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｎｄＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＰｅｓｔＭａｎａｇｅｍｅｎｔｏｎＴｒｏｐｉｃａｌＧｒｏｐｓꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＲｕｒａｌＡｆｆａｉｒｓꎬＨａｉｋｏｕ５７１１０１ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨａｉｋｏｕ５７１１０１ꎬＣｈｉｎａ)㊀㊀Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＲＡＶｇｅｎｅｉｎＭａｎｇｉｆｅｒａｉｎｄｉｃａꎬｔｈｅｓｅ￣ｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＲＡＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｕｓｉｎｇｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄｓꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＲＡＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙｑＲＴ￣ＰＣＲｄｕｒｉｎｇｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓａｎｄＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ.ｍａｎ￣ｇｉｆｅｒａｅｉｎｄｉｃａｅ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｉｘＲＡＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｈｅｍａｎｇｏｇｅｎｏｍｅꎬａｎｄｔｈｅｅｎｃｏ￣ｄｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｈａｄｔｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｓｏｆｔｈｅＡＰ２ａｎｄＢ３ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙꎬｎａｍｅｄＭｉＲＡＶ１￣ＭｉＲＡＶ６.ＭｉＲＡＶ１ａｎｄＭｉＲＡＶ５ｗｅｒｅｕｎｓｔａｂｌｅｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＭｉＲＡＶ２ａｎｄＭｉＲＡＶ３ｗｅｒｅｕｎｓｔａｂｌｅｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＭｉＲＡＶ４ｗａｓａｓｔａｂｌｅｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃａｃｉｄｉｃｐｒｏｔｅｉｎꎬａｎｄＭｉＲＡＶ６ｗａｓａｓｔａｂｌｅｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｂａｓｉｃｐｒｏｔｅｉｎ.ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｎｃｏｄｅｄｂｙＲＡＶｇｅｎｅｏｆｍａｎｇｏｗｅｒｅｍａｉｎｌｙｌｏｃａｔｅｄｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｕｓꎬａｎｄｒａｎｄｏｍｃｏｉｌａｎｄα￣ｈｅｌｉｘｗｅｒｅｔｈｅｍａｉｎｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｓｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｓｉｘＭｉＲＡＶｓｐｒｏｔｅｉｎｓ.ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｍｏｔｉｆａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔꎬａｍｏｎｇｍａｎｇｏａｎｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａꎬｔｏｂａｃｃｏꎬａｐ￣７５９ｐｌｅꎬｐｉｎｅａｐｐｌｅａｎｄＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａꎬｔｈｅＲＡＶｆａｍｉｌｙｇｅｎｅｓｗｅｒｅｄｉｖｅｒｓｅａｎｄｔｈｅｉｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅｗａｓｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｉｎｅｖｏｌｕｔｉｏｎ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＲＡＶｇｅｎｅｉｎｍａｎｇｏｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ.ＤｕｒｉｎｇｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓｐｖ.ｍａｎｇｉｆｅｒａｅｉｎｄｉｃａｅꎬｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭｉＲＡＶ１￣ＭｉＲＡＶ６ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄａｔ３ｈꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭｉＲＡＶ１ꎬＭｉＲＡＶ２ꎬＭｉＲＡＶ３ａｎｄＭｉＲＡＶ６ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｔ６ｈꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＭｉＲ￣ＡＶ１ꎬＭｉＲＡＶ５ａｎｄＭｉＲＡＶ６ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｔ１２ｈꎬ２４ｈꎬ４８ｈａｎｄ７２ｈꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｓｅｒｅｓｕｌｔｓｗｉｌｌｌａｙａｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＲＡＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｉｎｍａｎｇｏ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｍａｎｇｏꎻＲＡＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙꎻｇｅｎｏｍｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ㊀㊀转录因子ꎬ又称反式作用因子ꎬ其具有特殊的结构可调控基因表达ꎬ是植物中重要的调控因子ꎮ植物转录因子在胁迫反应中ꎬ对调控基因表达发挥重要作用[１￣３]ꎬ当植物受到逆境胁迫时ꎬ转录因子与相应的顺式作用元件结合ꎬ可以调控下游相关基因的表达[４]ꎮＲＡＶ(ＲｅｌａｔｅｄｔｏＡＢ１３/ＶＰ１)转录因子广泛存在于植物中ꎬ该家族同时具有２个保守结构域[５￣８]:位于Ｎ端ꎬ可与ＧＣＣ￣ｂｏｘ区域特异性结合的ＡＰ２结构域ꎻ位于Ｃ端ꎬ可与ＣＡＣＣＴＧ序列特异性结合的Ｂ３结构域[９]ꎮＶＰ１/ＡＢＩ３以及ＡＲＦｓ转录因子家族都具有该结构域ꎬ主要调控植物对生长素和脱落酸的反应[１０]ꎮＲＡＶ属于ＡＰ２/ＥＲＦ家族的一个亚家族ꎬ该家族还包含ＥＲＦ㊁ＡＰ２㊁ＤＲＥＢ亚家族[１１]ꎮ迄今为止ꎬＲＡＶ基因家族成员已在拟南芥(Ａｒａ￣ｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)[１２￣１３]㊁黄瓜(Ｃｕｃｕｍｉｓｓａｔｉｖｕｓ)[１４]㊁棉花(Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ)[１５]㊁东方山羊豆(Ｇａｌｅｇａｏｒｉｅｎｔａｌ￣ｉｓ)[１６]㊁烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ)[１７]㊁茶树(Ｃａｍｅｌｌｉａｓｉｎｅｎｓｉｓ)[１８]等植物中被陆续克隆和鉴定ꎮ例如:在拟南芥中发现７个ＲＡＶ基因家族成员ＡｔＲＡＶ１~Ａｔ￣ＲＡＶ７ꎬＡｔＲＡＶ１和ＡｔＲＡＶ２在拟南芥中参与应对外界胁迫和叶片衰老[１２￣１３]ꎻ黄瓜中ＣｓＲＡＶ在各个组织中均有表达[１４]ꎻ棉花中ＧｈＲＡＶ表达受黄萎病菌的诱导[１５]ꎻ东方山羊豆中ＧｏＲＡＶ表达不仅受低温和聚乙二醇的诱导ꎬ还受茉莉酸甲酯㊁水杨酸和脱落酸的诱导[１６]ꎻ烟草中ＧｍＲＡＶ过量表达会导致叶片失绿ꎬ同时抑制植株的生长[１７]ꎻ茶树中ＣｓＲＡＶ表达受ＮａＣｌ㊁乙烯和低温的诱导[１８]ꎮＲＡＶ基因广泛的分布表明它们在植物的生长发育和抗逆反应调控过程中起着非常重要的作用ꎮ杧果(Ｍａｎｇｉｆｅｒａｉｎｄｉｃａ)ꎬ被称为热带水果之王ꎬ是热带地区重要的果树ꎬ也是农民脱贫致富的 金杧果 和 致富树 ꎮ随着２０２０年杧果全基因组测序的完成[１９]ꎬ杧果基因功能的研究进程明显加快ꎬ然而目前国内外对杧果ＲＡＶ基因家族的研究还未见报道ꎮ为此ꎬ本研究对杧果ＲＡＶ基因家族成员的序列特征及其表达特性进行分析ꎬ为杧果基因功能的分析以及杧果的遗传育种等方面提供参考ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀杧果生物胁迫处理杧果嫁接苗由农业农村部儋州杧果种质资源圃提供ꎬ品种为贵妃杧ꎮ将株高约６０ｃｍꎬ均匀一致ꎬ树龄１年的杧果嫁接苗移栽到花盆内ꎬ以室温２５ħꎬ相对湿度７０％~９０％ꎬ光周期１２ｈ(光)/１２ｈ(暗)的条件下进行生物胁迫处理ꎮ设置胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌２个处理ꎬ每个处理３株苗ꎬ处理０ｈ作为对照ꎮ以分生孢子含量为１ｍｌ２ˑ１０６个的胶孢炭疽菌分生孢子悬浮液㊁含量为２ˑ１０７ＣＦＵ的细菌性黑斑病菌悬浮液分别对杧果嫁接苗叶片均匀喷雾ꎬ取样时间分别为０ｈ㊁３ｈ㊁６ｈ㊁１２ｈ㊁２４ｈ㊁４８ｈ㊁７２ｈꎬ将杧果叶片剪碎ꎬ液氮速冻ꎬ－８０ħ保存待用ꎮ１.２㊀杧果全基因组数据的来源杧果全基因组数据来源于ＮＣＢＩ(ＰＲＪＮＡ４８７１５４)ꎬ拟南芥㊁烟草㊁苹果(Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓ￣ｔｉｃａ)㊁菠萝(Ａｎａｎａｓｃｏｍｏｓｕｓ)㊁毛果杨(Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏ￣ｃａｒｐａ)５个物种的基因组和ＲＡＶ基因信息分别来源于ＮＣＢＩ(ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)和Ｐｌａｎｔ￣ＴＦＤＢ(ｈｔｔｐ://ｐｌａｎｔｔｆｄｂ.ｇａｏ￣ｌａｂ.ｏｒｇ/)数据库ꎮ１.３㊀杧果ＲＡＶ基因家族成员的鉴定从拟南芥数据库获取ＡｔＲＡＶ１~ＡｔＲＡＶ７氨基酸序列ꎬ并将其作为查询对象在杧果基因组数据库中执行Ｂｌａｓｔｐ比较(Ｅɤ１０－１０)ꎮ使用Ｐｆａｍ工具(ｈｔ￣ｔｐ://ｐｆａｍ.ｘｆａｍ.ｏｒｇ/)检测得到的杧果蛋白质氨基酸序列结构域ꎬ进一步去除没有典型ＡＰ２和Ｂ３结构域的蛋白质氨基酸序列ꎬ最终得到所有杧果ＲＡＶ基因家族成员[２０]ꎮ其他５个物种中的ＲＡＶ基因家族成员采用类似的方法进行筛选ꎮ８５９江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第４期１.４㊀杧果ＲＡＶ基因家族的生物信息学分析通过在线工具ＰｒｏｔＰａｒａｍ预测ＲＡＶ相对分子质量㊁等电点㊁外显子数㊁脂溶指数㊁氨基酸数等理化性质[２１]ꎻ利用ＰＳＯＲＴ在线软件进行亚细胞定位预测ꎻ通过ＳＯＰＭＡ在线软件预测蛋白质的二级结构ꎻ利用ＮＣＢＩＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＳｅａｒｃｈ预测ＲＡＶ的保守结构域ꎬ再通过ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ在线工具对蛋白质保守域的三级结构进行预测ꎻ利用ＭＥＭＥ在线软件对杧果ＲＡＶ家族的蛋白质保守基序进行分析[２２]ꎬ再通过ＤＮＡＭＡＮ６.０软件进行高同源蛋白的氨基酸序列比对ꎮ１.５㊀系统进化树分析利用ＣｌｕｓｔａｌＷ程序对杧果和拟南芥㊁烟草㊁苹果㊁菠萝㊁毛果杨的ＲＡＶ家族成员的氨基酸序列进行多序列比对ꎮ获得ＲＡＶ蛋白氨基酸序列后使用ＭＥＧＡ７.０软件ꎬ通过邻近法构建进化树ꎬ其中校验参数Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值设置为１０００次重复[２３]ꎮ１.６㊀ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ合成杧果叶片总ＲＮＡ提取参照ＲＮＡｐｒｅｐＰｕｒｅ多糖多酚植物总ＲＮＡ提取试剂盒(天根生化科技有限公司产品)说明书中的方法ꎮ利用ＲｅｖｅｒｔＡｉｄＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ试剂盒反转录成第１链ｃＤＮＡ[２４]ꎮ１.７㊀杧果ＲＡＶ基因家族表达分析利用ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ６Ｆｌｅｘ的实时荧光定量ＰＣＲ检测系统检测胶孢炭疽菌和细菌性黑斑病菌侵染下杧果ＲＡＶ家族基因的表达量ꎬ引物见表１ꎮ反应体系为１８ ０μｌꎬ设置２个复孔ꎮ反应程序参照ＵｌｔｒａＳＹＢＲＭｉｘｔｕｒｅ试剂盒说明书(北京康为世纪生物科技有限公司产品)进行设置ꎮ以杧果ＭｉＡｃｔｉｎ作为内参基因ꎬ０ｈ的表达量为对照ꎬ运用２－әәＣｔ法进行数据统计ꎬ确定ＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６的相对表达量[２５]ꎬ并通过ＨｅｍＩ１.０.３.７软件绘制热图ꎬ其中设置胶孢炭疽菌相对表达量热图参数(条形图的数量)为１１ꎬ小数点位数值为２ꎬ最小值为－２０ꎬ阶跃值为２ꎻ设置细菌性黑斑病菌相对表达量热图参数(条形图的数量)为１１ꎬ小数点位数值为２ꎬ最小值为－２ꎬ阶跃值为２ꎮ整个表达矩阵每个值进行对数转化ꎬ底数为２ꎮ表１㊀ｑＲＴ￣ＰＣＲ引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀ｑＲＴ￣ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ基因前引物(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀后引物(５ᶄң３ᶄ)㊀㊀㊀片段大小(ｂｐ)熔解曲线温度(ħ)ＭｉＲＡＶ１ＡＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＧＴＣＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴ２０９８１.６９ＭｉＲＡＶ２ＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＣ２３５７４.１５ＭｉＲＡＶ３ＡＧＡＡＧＣＡＴＣＡＡＣＧＧＧＴＡＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＣＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＴＣ２３５７１.７９ＭｉＲＡＶ４ＴＧＣＣＣＴＡＡＡＴＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＣＴＣＡＣＡＡＣＧＡＴＡＡＡ１９０７３.７５ＭｉＲＡＶ５ＧＣＡＴＣＡＣＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＣＣＡＣＴＧＡＡＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＧＣＡＣＡ１９７７７.７９ＭｉＲＡＶ６ＣＧＡＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＡＧＡＡＡＧＣＧＣＣＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴ２０７８０.５２ＭｉＡｃｔｉｎＧＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＴＴＧＴＧＧＧＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＡＴＣＡＴＣＣＣＡＧＴＴ１６７８３.７３２㊀结果与分析２.１㊀全基因组水平鉴定杧果ＲＡＶ基因家族成员在杧果基因组数据库中进行Ｂｌａｓｔｐ检索ꎬ发现杧果ＲＡＶ基因家族有６个成员ꎬ分别命名为ＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６ꎮ通过生物学在线分析工具Ｐｒｏｔ￣Ｐａｒａｍ对杧果ＲＡＶ基因家族６个成员ＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６编码的蛋白质氨基酸序列的理化性质进行了分析ꎬ结果(表２)表明ꎬ６个ＭｉＲＡＶｓ蛋白相对分子质量为３２５２３３４０~４４１２２２８０ꎬ蛋白质等电点为５.８３~９ ３４ꎬ外显子数均为２ꎬ脂溶指数为５８.９３~７４ ３１ꎬ氨基酸数为２８１~３９２个ꎬ不稳定指数为３４.１４~４６.６１ꎬ亲水性平均数为－０.５０６~－０.８６３ꎮ因此ꎬ预测这６个ＭｉＲＡＶｓ蛋白中ＭｉＲＡＶ１和ＭｉＲＡＶ５为不稳定亲水碱性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ２~ＭｉＲＡＶ３为不稳定亲水酸性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ４为稳定亲水酸性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ６为稳定亲水碱性蛋白质ꎮ㊀㊀对杧果ＲＡＶ家族成员进行亚细胞定位预测ꎬ结果(表３)显示ꎬ它们主要定位于细胞核中ꎬ其次定位于叶绿体和细胞质中ꎬ推断该家族成员主要存在于进行光合作用的器官中ꎮ其中ꎬ只有ＭｉＲＡＶ１和ＭｉＲＡＶ４没有定位于叶绿体ꎬＭｉＲＡＶ４和ＭｉＲＡＶ６没９５９孙㊀宇等:杧果ＲＡＶ基因家族的全基因组分析有定位于细胞质ꎬ线粒体㊁过氧化氢酶体ꎬ质膜定位的ＭｉＲＡＶｓ成员最少ꎮ表２㊀杧果ＲＡＶ家族蛋白质基本信息Ｔａｂｌｅ２㊀ＢａｓｉｃｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＲＡＶｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｍａｎｇｏ蛋白质㊀氨基酸序列相对分子质量等电点脂溶指数氨基酸数不稳定指数亲水性平均系数ＭｉＲＡＶ１ＧＷＨＰＡＢＬＡ０１１３７４４４１２２２８０９.３４７４.３１３９２４２.３２－０.５６０ＭｉＲＡＶ２ＧＷＨＰＡＢＬＡ０２０５４７３２５２３３４０５.８３５８.９３２８１４０.０９－０.８２８ＭｉＲＡＶ３ＧＷＨＰＡＢＬＡ０２０７６４３２５７４４７０５.８９５９.９６２８１４１.０５－０.８１６ＭｉＲＡＶ４ＧＷＨＰＡＢＬＡ０２２４２１３８５８８９５０６.７３５９.６１３３２３４.１４－０.８６３ＭｉＲＡＶ５ＧＷＨＰＡＢＬＡ０２５９９５３９７１７０５０７.０８６９.９７３４４４６.６１－０.５０６ＭｉＲＡＶ６ＧＷＨＰＡＢＬＡ０３３５８７４０５７５８６０９.０３６７.７８３６１３６.１８－０.５９１表３㊀杧果ＲＡＶ家族蛋白质亚细胞定位预测Ｔａｂｌｅ３㊀ＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｌｏｃａｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＲＡＶｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｍａｎｇｏ蛋白质细胞核叶绿体细胞外细胞质细胞骨架线粒体过氧化物酶体质膜液泡ＭｉＲＡＶ１１１－－２１－－－－ＭｉＲＡＶ２８１１１－－２－１ＭｉＲＡＶ３１０１１１－１－－－ＭｉＲＡＶ４１３－－－－－－１－ＭｉＲＡＶ５１０１－３－－－－－ＭｉＲＡＶ６１１１－－１－－－１－ 表示没有定位到ꎮ㊀㊀通过ＳＯＰＭＡ在线软件对ＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６蛋白进行二级结构预测ꎮ如图１所示ꎬ６个ＭｉＲＡＶｓ蛋白无规则卷曲结构占比为４４.５８％~５４ ８５％ꎬα￣螺旋结构占比为２１.８８％~３１ ６７％ꎬ延伸链结构占比为１６.８６％~１９ １３％ꎬβ￣转角结构占比为４.８５％~７ ５６％ꎮ因此ꎬ预测无规则卷曲和α￣螺旋是６个ＭｉＲＡＶｓ蛋白二级结构的主要元件ꎬ其次是延伸链和β￣转角ꎮ㊀㊀通过ＮＣＢＩＣｏｎｓｅｒｖｅｄＤｏｍａｉｎＳｅａｒｃｈ对杧果ＲＡＶ家族蛋白质氨基酸序列进行保守结构域分析ꎬ发现ＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６蛋白均含有ＡＰ２和Ｂ３超家族保守域(图２)ꎮ６个ＭｉＲＡＶｓ蛋白ＡＰ２超家族保守域位置介于１８~１２４ꎻＢ３超家族保守域位置介于１３７~２９１ꎮ基于同源建模原理ꎬ通过ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ软件对杧果ＲＡＶ蛋白的２个保守结构域(ＡＰ２㊁Ｂ３)三级结构进行预测ꎬ发现在ＡＰ２保守结构域中ꎬ含有１个α￣螺旋和３个反向平行的β￣转角ꎻＢ３保守结构域中ꎬ含有１个α￣螺旋㊁２个反向平行的β￣折叠和延伸链ꎮ２.２㊀杧果ＲＡＶ蛋白系统进化树分析为了更好地了解杧果ＲＡＶ基因家族的系统发育关系ꎬ将杧果(６个)㊁拟南芥(７个)㊁烟草(５个)㊁苹果(１１个)㊁菠萝(２个)㊁毛果杨(５个)ＲＡＶ基因编码的蛋白质氨基酸序列通过Ｂｌａｓｔ工具进行蛋白质氨基酸序列分析ꎬ利用ＣｌｕｓｔａｌＷ程序和ＭＥＧＡ７.０软件构建６个杧果ＲＡＶ蛋白与其他物种(共５种)植物ＲＡＶ蛋白系统进化树(图３)ꎬ将３６个ＲＡＶ成员分成３个分支(ＣｌａｓｓⅠ㊁ＣｌａｓｓⅡ和ＣｌａｓｓⅢ)ꎬ结果显示ꎬ６个物种的ＲＡＶ蛋白家族成员相互嵌合在一起ꎬ表明植物ＲＡＶ在进化过程中相对保守ꎮ每个分支中均存在２个杧果ＲＡＶ成员ꎬ其中ꎬＣｌａｓｓⅠ包含杧果２个㊁拟南芥２个㊁毛果杨３个㊁苹果５个和烟草１个ꎻＣｌａｓｓⅡ包含杧果２个㊁苹果４个㊁菠萝２个和拟南芥５个ꎻＣｌａｓｓⅢ包含杧果２个㊁毛果杨２个㊁烟草４个和苹果２个ꎮ在３６个ＲＡＶ成员中ꎬＭｉＲＡＶ１㊁ＭｉＲＡＶ６分别与ＭＤＰ００００１２８９２４㊁ＭＤＰ００００９３９６３３亲缘关系最近ꎬＭｉＲ￣ＡＶ２㊁ＭｉＲＡＶ３分别与ＡｔＲＡＶ１㊁ＡｔＲＡＶ７亲缘关系最近ꎬＭｉＲＡＶ４与ＭＤＰ００００２０７７２２㊁ＭＤＰ００００４８５２８０亲缘关系最近ꎬＭｉＲＡＶ５与Ｐｏｔｒｉ.０１８Ｇ１０９２００.１㊁Ｐｏｔｒｉ.０１８Ｇ１０９２００.２亲缘关系最近ꎮ因此ꎬ推测ＲＡＶ家族蛋白质不仅具有多样性ꎬ对于亲缘关系较近的蛋白质ꎬ它们还具有相似或相近的生物学功能ꎮ０６９江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第４期图１㊀杧果ＲＡＶ家族的二级结构预测Ｆｉｇ.１㊀ＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＲＡＶｆａｍｉｌｙｉｎｍａｎｇｏ２.３㊀杧果ＲＡＶ家族蛋白质ｍｏｔｉｆ和保守结构域分析㊀㊀基于在线软件ＭＥＭＥ对杧果㊁拟南芥㊁烟草㊁苹果㊁菠萝㊁毛果杨ＲＡＶ转录因子家族的蛋白质保守基序进行分析(图４)ꎬ在ＲＡＶ转录因子家族中鉴定出５个保守基序ꎬ主要的保守基序有４个(ｍｏｔｉｆ１~ｍｏｔｉｆ４)ꎬＮ端均存在保守的ｍｏｔｉｆ１ꎬＣ端均存在保守的ｍｏｔｉｆ２ꎮ其中ꎬＭｉＲＡＶ４~ＭｉＲＡＶ５㊁ＡｔＲＡＶ３~ＡｔＲＡＶ４㊁ＭＤＰ００００５２６５８４㊁ＭＤＰ００００５３４７８０㊁ＭＤＰ００００１６５８０２㊁ＭＤＰ００００２０７７２２㊁ＭＤＰ００００４８５２８０㊁Ｐｏｔｒｉ.０１８Ｇ１０９２００.１㊁Ｐｏｔｒｉ.０１８Ｇ１０９２００.２㊁Ｐｏｔｒｉ.００３Ｇ２１２８００.１㊁ＸＰ＿０１６４９２３２２.１不含有ｍｏｔｉｆ５ꎮ通过基序分析发现ꎬＲＡＶ基因家族在进化上结构具有保守性ꎮ㊀㊀通过ＤＮＡＭＡＮ６.０软件对杧果６个ＲＡＶ蛋白和拟南芥７个㊁烟草５个㊁苹果１１个㊁菠萝２个㊁毛果杨５个ＲＡＶ蛋白进行多序列比对ꎮ结果(图５)发现ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６与５个物种的ＲＡＶ转录因子家族存在２个相似的保守域Ａ和保守域Ｂꎬ保守域Ａ与ｍｏｔｉｆ１基本重叠ꎬ保守域Ｂ与ｍｏｔｉｆ２㊁ｍｏｔｉｆ３基本重叠ꎮ因此ꎬ可以推测ｍｏｔｉｆ１㊁ｍｏｔｉｆ２和ｍｏｔｉｆ３是构成ＡＰ２㊁Ｂ３结构域的主要结构ꎮ２.４㊀杧果ＲＡＶ基因家族的胁迫响应以杧果ＭｉＡｃｔｉｎ作为内参基因ꎬ０ｈ处理作为对照ꎬ利用ｑＲＴ￣ＰＣＲ检测并分析了２种病原菌侵染过程中杧果ＲＡＶ家族基因的表达程度ꎮｑＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６和内参基因ＭｉＡｃｔｉｎ的熔解曲线为单峰ꎬ熔解温度分别为８１ ６９ħ㊁７４ １５ħ㊁７１ ７９ħ㊁７３ ７５ħ㊁７７ ７９ħ㊁８０ ５２ħ㊁８３ ７３ħꎬ将ｑＲＴ￣ＰＣＲ产物经２％的琼脂糖凝胶进行电泳ꎬ结果(图６)显示ꎬ目标条带单一ꎬ清晰ꎬ与预计大小一致ꎬ说明所设计的引物具有特异性ꎻ杧果胶孢炭疽菌侵染过程中(图７Ａ)ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６的相对表达量均显著下调ꎬ其中ＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６相对表达量在６ｈ时达到最低值ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ５的相对表达量在７２ｈ时达到最高值ꎬＭｉＲＡＶ６的相对表达量在４８ｈ时达到最高值ꎻ杧果细菌性黑斑病菌侵染过程中(图７Ｂ)ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６的相对表达量在３ｈ时均显著下调ꎬＭｉＲＡＶ１㊁ＭｉＲＡＶ２㊁ＭｉＲＡＶ３和ＭｉＲ￣ＡＶ６的相对表达量在６ｈ时显著上调ꎬＭｉＲＡＶ１㊁ＭｉＲ￣ＡＶ５和ＭｉＲＡＶ６的相对表达量分别在１２ｈ㊁２４ｈ㊁４８１６９孙㊀宇等:杧果ＲＡＶ基因家族的全基因组分析Ａ:ＭｉＲＡＶ１ꎻＢ:ＭｉＲＡＶ２ꎻＣ:ＭｉＲＡＶ３ꎻＤ:ＭｉＲＡＶ４ꎻＥ:ＭｉＲＡＶ５ꎻＦ:ＭｉＲＡＶ６ꎻＧ:ＭｉＲＶＡ蛋白ＡＰ２三级结构预测模型ꎻＨ:ＭｉＲＶＡ蛋白Ｂ３三级结构预测模型ꎮ图２㊀杧果ＲＡＶ蛋白保守结构域分析及三级结构预测Ｆｉｇ.２㊀ＣｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｔｅｒｔｉａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＲＡＶｐｒｏｔｅｉｎｉｎｍａｎｇｏｈ㊁７２ｈ时均显著上调ꎮ结果表明ꎬ在不同病原菌侵染过程中ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６的相对表达量与对照差异显著ꎮ３㊀讨论基因组测序技术的提高和分子生物学研究的深入ꎬ为植物基因家族的鉴定㊁功能基因的挖掘提供了基础ꎬ大量植物全基因组已经被成功测序ꎮＲＡＶ家族是一类植物特异的转录因子ꎬ广泛存在于植物细胞内ꎮ在拟南芥[１２￣１３]㊁黄瓜[１４]㊁棉花[１５]㊁东方山羊豆[１６]㊁烟草[１７]㊁茶树[１８]等中关于ＲＡＶ已开展相应研究ꎬ主要体现在参与应对外界胁迫和叶片衰老等方面功能ꎬ但关于其杧果ＲＡＶ转录因子家族的研究至今仍未见报道ꎮ本研究在杧果全基因组水平鉴定到６个ＲＡＶ基因ꎬ理化性质分析结果表明ꎬＭｉＲＡＶ１和ＭｉＲＡＶ５２６９江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第４期图３㊀３６个ＲＡＶ蛋白系统进化树Ｆｉｇ.３㊀Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｒｏｍ３６ＲＡＶｐｒｏｔｅｉｎｓ为不稳定亲水碱性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ２和ＭｉＲＡＶ３为不稳定亲水酸性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ４为稳定亲水酸性蛋白质ꎬＭｉＲＡＶ６为稳定亲水碱性蛋白质ꎮ杧果ＲＡＶ蛋白主要存在于细胞核中ꎬ无规则卷曲和α￣螺旋是６个ＭｉＲＡＶｓ蛋白二级结构的主要元件ꎬ均具有ＡＰ２和Ｂ３超家族保守域结构ꎬＡＰ２保守域三级结构含有１个α￣螺旋和３个反向平行的β￣转角ꎬＢ３保守域三级结构含有１个α￣螺旋㊁２个反向平行的β￣折叠和延伸链ꎬ据此推断它们在调控生物性状上存在协同作用ꎮ杧果与拟南芥㊁烟草㊁苹果㊁菠萝㊁毛果杨ＲＡＶ蛋白家族构建系统进化树结合基序分析结果显示ꎬ６个物种的ＲＡＶ蛋白家族成员相互嵌合在一起ꎬ表明植物ＲＡＶ基因在进化过程中相对保守ꎻ在模式植物拟南芥中参与应对外界胁迫和叶片衰老的基因ＡｔＲＡＶ１和ＡｔＲＡＶ２被聚类到ＣｌａｓｓⅡ中ꎬ因此ꎬ推断该ＣｌａｓｓⅡ分支下的杧果ＭｉＲＡＶ２和ＭｉＲ￣ＡＶ３基因可能与应对外界胁迫和叶片衰老有关[１２￣１３]ꎻ对于亲缘关系较近的蛋白质ꎬ推断它们还具有相似或相近的生物学功能ꎻ杧果ＲＡＶ蛋白主要的保守基序有４个(ｍｏｔｉｆ１~ｍｏｔｉｆ４)ꎬＮ端均存在保守的ｍｏｔｉｆ１ꎬＣ端均存在保守的ｍｏｔｉｆ２ꎬｍｏｔｉｆ１~ｍｏｔｉｆ３与卢合均等[１５]研究棉花时所鉴定到的ｍｏｔｉｆ１~ｍｏｔｉｆ３基本一致ꎬｍｏｔｉｆ１与韩林贺等[２６]研究普通烟草时所鉴定到的ｍｏｔｉｆ１基本一致ꎻ杧果与其他５个物种ＲＡＶ蛋白进行多序列比对结果显示ꎬ存在２个明显的保守域Ａ和保守域Ｂꎬ保守域Ａ与ｍｏｔｉｆ１基本重叠ꎬ保守域Ｂ与ｍｏｔｉｆ２㊁ｍｏｔｉｆ３基本重叠ꎬ因此ꎬ可以推测ｍｏｔｉｆ１是构成ＡＰ２的主要结构ꎬｍｏｔｉｆ２和３６９孙㊀宇等:杧果ＲＡＶ基因家族的全基因组分析４６９江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第４期Ａ:ＲＡＶ家族ｍｏｔｉｆ分析ꎻＢ:ＭＥＭＥ预测的５ꎮ图４㊀３６个ＲＡＶ蛋白保守基序分析Ｆｉｇ.４㊀Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄｍｏｔｉｆａｎａｌｙｓｉｓｏｆ３６ＲＡＶｐｒｏｔｅｉｎｓＡ:杧果㊁菠萝㊁毛果杨㊁拟南芥㊁苹果和烟草ＲＡＶ蛋白中ＡＰ２结构域的多序列比对ꎻＢ:杧果㊁菠萝㊁毛果杨㊁拟南芥㊁苹果和烟草ＲＡＶ蛋白中Ｂ３结构域的多序列比对ꎮ图５㊀杧果与其他５个物种ＲＡＶ蛋白保守域序列分析Ｆｉｇ.５㊀ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＡＶｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｓｅｒｖｅｄｄｏｍａｉｎｉｎｍａｎｇｏａｎｄｆｉｖｅｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓｍｏｔｉｆ３是构成Ｂ３的主要结构ꎮ中国杧果病害危害严重ꎬ常见的病害有炭疽病㊁细菌性黑斑病㊁白粉病㊁蒂腐病㊁疮痂病等[２７￣２８]ꎬ其中ꎬ杧果胶孢炭疽病与细菌性黑斑病为害杧果最为严重[２９￣３０]ꎮ为了解杧果ＲＡＶ基因在胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌侵染下相对表达量的变化ꎬ对杧果叶片进行胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌生物胁迫处理ꎬ并通过ｑＲＴ￣ＰＣＲ技术研究胶孢炭疽菌与细菌性５６９孙㊀宇等:杧果ＲＡＶ基因家族的全基因组分析图６㊀ｑＲＴ￣ＰＣＲ产物电泳图Ｆｉｇ.６㊀ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｑＲＴ￣ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓＡ:杧果胶孢炭疽菌侵染过程中ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６的相对表达量ꎻＢ:杧果细菌性黑斑病菌侵染过程中ꎬＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６的相对表达量ꎮ图７㊀杧果ＲＡＶ基因家族在不同病原菌胁迫下的表达Ｆｉｇ.７㊀ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＲＡＶｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｍａｎｇｏｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓｔｒｅｓｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ黑斑病菌侵染过程中杧果ＲＡＶ家族基因的相对表达量ꎮ结果显示ꎬ在不同病原菌侵染过程中ꎬＭｉＲ￣ＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６的相对表达量与对照差异显著ꎬ表明ＭｉＲＡＶ１~ＭｉＲＡＶ６对生物胁迫有响应ꎮＲＡＶ基因家族的表达分析研究ꎬ更多集中在ＭｅＪＡ[１６]㊁ＮａＣｌ[１８]㊁ＡＢＡ和低温[２６]等非生物胁迫上ꎬ也有前人在研究中提到ＲＡＶ基因对棉花黄萎病菌[１５]㊁番茄青枯病菌[３１]等生物胁迫的响应ꎬ本研究通过对杧果接种胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌后的分析ꎬ发现了此家族的部分成员在胶孢炭疽菌与细菌性黑斑病菌侵染植株之后出现上调表达的现象ꎬ表明ＲＡＶ基因可能在杧果提高抗炭疽病和细菌性黑斑病的能力方面起着积极作用ꎬ如ＭｉＲＡＶ１㊁ＭｉＲＡＶ５㊁ＭｉＲＡＶ６在细菌性黑斑病菌侵染后的１２~７２ｈ显著上调表达ꎬ可以作为后续研究杧果抗细菌性黑斑病机制的候选基因ꎬ这也在分子水平上拓宽了杧果响应生物胁迫的机制ꎮ参考文献:[１]㊀ＯＨＡＭＡＮꎬＳＡＴＯＨꎬＳＨＩＮＯＺＡＫＩＫꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕ￣ｌａｔｏｒｙｎｅｔｗｏｒｋｏｆｐｌａｎｔｈｅａｔｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１７ꎬ２２(１):５３￣６５.[２]㊀ＫＩＭＹＳꎬＡＮＣꎬＰＡＲＫＳꎬｅｔａｌ.ＣＡＭＴＡ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓａｌｉｃｙｌｉｃａｃｉｄｉｍｍｕｎｉｔｙｐａｔｈｗａｙｇｅｎｅｓｉｎａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｅｘｐｏｓｅｄｔｏｌｏｗｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１７ꎬ２９(１０):２４６５￣２４７７.[３]㊀ＰＲＡＳＡＤＫＶＳＫꎬＡＢＤＲＬ￣ＨＡＭＥＥＤＡＡＥꎬＸＩＮＧＤꎬｅｔａｌ.ＧｌｏｂａｌｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＲＮＡ￣ｓｅｑｕｎｃｏｖｅｒｅｄａｎｅｗｒｏｌｅｆｏｒＳＲ１/ＣＡＭＴＡ３ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｎｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎ￣ｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６(１):４４３￣４４８.[４]㊀ＳＣＨＷＥＣＨＨＥＩＭＥＲＣꎬＢＥＶＡＮＭ.Ｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＴｒｅｎｄｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ１９９８ꎬ３(１０):２７８￣２８３.６６９江苏农业学报㊀２０２１年第３７卷第４期[５]㊀ＧＩＲＡＵＤＡＴＪꎬＨＡＵＧＥＢＭꎬＶＡＬＯＮＣꎬｅｔａｌ.ＩｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＡＢＩ３ｇｅｎｅｂｙｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｃｌｏｎｉｎｇ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ１９９２ꎬ４(１０):１２５１￣１２６１.[６]㊀ＳＵＺＵＫＩＭꎬＫＡＯＣＹꎬＭＣＣＡＲＴＹＤＲ.ＴｈｅｃｏｎｓｅｒｖｅｄＢ３ｄｏ￣ｍａｉｎｏｆＶＩＶＩＰＡＲＯＵＳ１ｈａｓａｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌＯｎｌｉｎｅꎬ１９９７ꎬ９(５):７９９￣８０７. [７]㊀ＲＩＥＣＨＭＡＮＮＪＬꎬＬＡＩＮＳꎬＧＡＲＣＩＡＪＡ.Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓａｎｄｐｒｏｓ￣ｐｅｃｔｓｏｆｐｏｔｙｖｉｒｕｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏ￣ｇｙꎬ１９９２ꎬ７３(１):１￣１６.[８]㊀ＫＡＧＡＹＡＹꎬＯＨＭＩＹＡＫꎬＨＡＴＴＯＲＩＴ.ＲＡＶ１ꎬａｎｏｖｅｌＤＮＡ￣ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎꎬｂｉｎｄｓｔｏｂｉｐａｒｔｉｔｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｔｈｒｏｕｇｈｔｗｏｄｉｓｔｉｎｃｔＤＮＡ￣ｂｉｎｄｉｎｇｄｏｍａｉｎｓｕｎｉｑｕｅｌｙｆｏｕｎｄｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓꎬ１９９９ꎬ２７(２):４７０.[９]㊀ＲＩＥＣＨＭＡＮＮＪＬꎬＨＥＡＲＤＪꎬＭＡＲＴＩＮＧꎬｅｔａｌ.Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓ:ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓａｍｏｎｇｅｕ￣ｋａｒｙｏｔｅｓ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０００ꎬ２９０(１０):２１０５.[１０]ＦＩＮＫＥＬＳＴＥＩＮＲＲꎬＷＡＮＧＭＬꎬＬＹＮＣＨＴＪꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅａｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｒｅｓｐｏｎｓｅｌｏｃｕｓＡＢＩ４ｅｎｃｏｄｅｓａｎＡＰＥＴＡＬＡ２ｄｏｍａｉｎｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ１９９８ꎬ１０(６):１０４３.[１１]孙㊀尧ꎬ孙㊀鑫ꎬ王㊀雷.毛果杨ＲＡＶ/ＰＬＣ基因生物信息学分析[Ｊ].广东农业科学ꎬ２０１９ꎬ４６(１２):３６￣４１ꎬ１５３.[１２]ＨＵＹＸꎬＷＡＮＧＹＸꎬＬＩＵＸＦꎬｅｔａｌ.ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＲＡＶ１ｉｓｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄｂｙｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄａｎｄｍａｙａｃｔａｓａｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕ￣ｌａｔｏｒｄｕｒｉｎｇｐｌａｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００４ꎬ１４(１):８￣１５.[１３]ＳＯＨＮＫＨꎬＬＥＥＳＣꎬＪＵＮＧＨＷꎬｅｔａｌ.Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃ￣ｔｉｏｎａｌｒｏｌｅｓｏｆｔｈｅｐｅｐｐｅｒｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｄｕｃｅｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＲＡＶ１ｉｎｂａｃｔｅｒｉａｌｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎬａｎｄｄｒｏｕｇｈｔａｎｄｓａｌｔｓｔｒｅｓｓｔｏｌｅｒａｎｃｅ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ６１(６):８９７￣９１５. [１４]蒋伦伟ꎬ胡丽芳ꎬ袁永成ꎬ等.黄瓜ＲＡＶ基因家族的全基因组分析[Ｊ].中国蔬菜ꎬ２０１２ꎬ１(１６):１５￣２１.[１５]卢合均ꎬ周忠丽ꎬ陈浩东ꎬ等.棉花ＲＡＶ基因家族的全基因组分析[Ｊ].棉花学报ꎬ２０１４ꎬ２６(６):４７１￣４８２.[１６]ＣＨＥＮＸꎬＷＡＮＧＺꎬＷＡＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣ｔｉｏｎｏｆＧｏＲＡＶꎬａｎｏｖｅｌｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇａＲＡＶ￣ｔｙｐｅｐｒｏｔｅｉｎｉｎＧａｌｅｇａｅｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ[Ｊ].ＧｅｎｅｓＧｅｎｅｔＳｙｓｔꎬ２００９ꎬ８４(２):１０１. [１７]ＳＲＩＮＩＶＡＳＡＮＣꎬＬＩＵＺＲꎬＨＥＩＤＭＡＮＮＩꎬｅｔａｌ.ＨｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＢＡＢＹＢＯＯＭＡＰ２/ＥＲＦｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｅｎ￣ｈａｎｃｅｓｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆｔｏｂａｃｃｏ(ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ.)[Ｊ].Ｐｌａｎｔａꎬ２００７ꎬ２２５:３４１￣３５１.[１８]陈林波ꎬ李叶云ꎬ王㊀琴ꎬ等.茶树冷诱导基因ＲＡＶ的克隆与表达特性分析[Ｊ].植物生理学通讯ꎬ２０１０ꎬ４６(４):３５４. [１９]ＰＥＮＧＷꎬＹＩＮＧＦＬꎬＪＩＡＮＦＨꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｇｅｎｏｍｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒｏｐｉｃａｌｆｒｕｉｔｍａｎｇｏ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２０ꎬ２１(１).Ｄｏｉ:１０.１１８６/ｓ１３０５９￣０２０￣０１９５９￣８.[２０]ＦＩＮＮＲＤꎬＣＯＧＧＩＬＬＰꎬＥＢＥＲＨＡＲＤＴＲＹꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｐｆａｍｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｉｅｓｄａｔａｂａｓｅ:ｔｏｗａｒｄｓａｍｏｒｅｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅｆｕｔｕｒｅ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１６ꎬ４４:２７９￣２８５.[２１]ＧＡＳＴＥＩＧＥＲＥꎬＧＡＴＴＩＫＥＲＡꎬＨＯＯＧＬＡＮＤＣꎬｅｔａｌ.ＥｘＰＡＳｙ:ｔｈｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓｓｅｒｖｅｒｆｏｒｉｎ￣ｄｅｐｔｈｐｒｏｔｅｉｎｋｎｏｗｌｅｄｇｅａｎｄａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００３ꎬ３１(１３):３７８４￣３７８８. [２２]ＢＡＩＬＥＹＴＬꎬＢＯＤＥＮＭꎬＢＵＳＫＥＦＡꎬｅｔａｌ.ＭＥＭＥＳＵＩＴＥ:ｔｏｏｌｓｆｏｒｍｏｔｉｆｄｉｓｃｏｖｅｒｙａｎｄｓｅａｒｃｈｉｎｇ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅ￣ｓｅａｒｃｈꎬ２００９ꎬ３７:２０２￣２０８.[２３]ＫＵＭＡＲＳꎬＳＴＥＣＨＥＲＧꎬＴＡＭＵＲＫ.ＭＥＧＡ７:ｍｏｌｅｃｕｌａｒｅｖｏｌｕ￣ｔｉｏｎａｒｙｇｅｎｅｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓＶｅｒｓｉｏｎ７.０ｆｏｒｂｉｇｇｅｒｄａｔａｓｅｔｓ[Ｊ].Ｍｏｌｅｃ￣ｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｖｏｌｕｔｉｏｎꎬ２０１６ꎬ３３(７):１８７０￣１８７４. [２４]夏㊀杨ꎬ苏初连ꎬ晁㊀骏ꎬ等.菠萝ＶＯＺ转录因子序列特征及其对非生物胁迫的响应[Ｊ].西北植物学报ꎬ２０１８ꎬ３８(７):１２２８￣１２３４.[２５]ＬＩＶＡＫＫＪꎬＳＣＨＭＩＴＴＧＥＮＴＤ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｉｖｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓ￣ｓｉｏｎｄａｔａｕｓｉｎｇｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲａｎｄｔｈｅ２[￣ＤｅｌｔａＤｅｌｔａＣ(Ｔ)]ｍｅｔｈｏｄ[Ｊ].Ｍｅｔｈｏｄｓ￣ＡＣｏｍｐａｎｉｏｎｔｏＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙ￣ｍｏｌｏｇｙꎬ２００１ꎬ２５(４):４０２￣４０８.[２６]韩林贺ꎬ徐同庆ꎬ任昂彦ꎬ等.普通烟草ＲＡＶ家族基因结构与功能分析[Ｊ].基因组学与应用生物学ꎬ２０１９ꎬ３８(４):１６５８￣１６６５.[２７]蒲金基ꎬ张㊀贺ꎬ周文忠.芒果病害综合防治技术[Ｊ].中国热带农业ꎬ２０１５(３):３８￣４２.[２８]杨郑州ꎬ黄柳芳ꎬ谢晓娜ꎬ等.叶疫病菌侵染芒果后叶片细胞壁降解酶活性测定[Ｊ].江苏农业科学ꎬ２０１９ꎬ４７(１０):１３８￣１４１. [２９]喻群芳ꎬ漆艳香ꎬ张辉强ꎬ等.４种生防菌对芒果细菌性黑斑病的田间防效[Ｊ].中国热带农业ꎬ２０１９(３):２３￣２５.[３０]于海英ꎬ兰建强ꎬ王晓燕ꎬ等.芒果胶孢炭疽菌致病性的初步研究[Ｃ]//中国植物病理学会.中国植物病理学会２０１２年学术年会论文集.北京:中国农业科学技术出版社ꎬ２０１２:２１０￣２１３. [３１]ＬＩＣＷꎬＳＵＲＣꎬＣＨＥＮＧＣＰꎬｅｔａｌ.ＴｏｍａｔｏＲＡＶｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｉｓａｐｉｖｏｔａｌｍｏｄｕｌａｔｏｒｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅＡＰ２/ＥＲＥＢＰ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｄｅｆｅｎｓｅｐａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ１５６(１):２１３￣２２７.(责任编辑:陈海霞)７６９孙㊀宇等:杧果ＲＡＶ基因家族的全基因组分析。

安徽农学通报2023年22期林业科学毛果杨RAV基因家族生物信息学与组织表达分析范文欣刘秋艳陈甜王一淇王海凌王晓立*（宿迁学院建筑工程学院园林教研室，江苏宿迁223800）摘要鉴定毛果杨基因组上RAV同源蛋白（PtRAV），为进一步分析毛果杨RAV同源蛋白基因提供信息。

从Phytozome数据库中查找已知RAV基因保守蛋白序列，通过毛果杨数据库得到毛果杨全基因组RAV保守蛋白序列。

解析RAV基因物理化学性质和亚细胞定位用，构建系统发育树以及组织表达。

本研究有利于为后续克隆毛果杨RAV基因提供信息，并为RAV同源蛋白功能的解析、调控网络的构建以及为植物的生长发育及抗逆中的作用提供一定的参考。

关键词毛果杨；RAV；理化性质分析；组织表达中图分类号Q811.4文献标识码A文章编号1007-7731（2023）22-0069-05毛果杨（Populus trichocarpa）为杨柳科半常绿乔木，具有易繁殖、生长迅速等特点，是木本植物研究的模式生物。

转录因子是一类能够与DNA序列特异性结合[1]，调节基因转录本表达的蛋白质。

转录因子在植物的生长发育、代谢反应和抗逆反应等多种过程中发挥重要作用[2]。

RAV属于AP2/ERF 转录因子家族的一个亚家族，仅在植物中存在，对植物的多个生物学过程有重要意义。

RAV蛋白同时含有B3保守域和AP2保守域[3]，其中B3保守域能特异地与靶序列CACCTG结合，处于蛋白C端；处于蛋白N端的AP2结构域则与GCC盒结合密切相关。

相关学者已在多个植物中对RAV家族进行了全基因组分析：荔枝[4]（Litchi chinensis）和杧果[5]（Mangifera indica）中鉴定得到4个RAV转录因子；新疆沙冬青[6]（Ammopiptanthus mongolicus）、钻天柳[7]（Chosenia arbutifolia）、二倍体棉花[8]（Gossypium australe）和龙眼[9]（Dimocarpus longan）中的RAV成员数量分别是2、4、10和4个；在拟南芥中[10]鉴定有13个RAV基因，其中有6个具有AP2结构域，其他则只具有B3结构域。

第 36卷第 4期 2012年 7月南京林业大学学报 (自然科学版Journal of Nanjing Forestry University (Natural Science EditionVol．36, No．4Jul．, 2012收稿日期 :2011－12－02修回日期 :2012－04－06基金项目 :国家自然科学基金项目 (30871727 ; 高等学校博士学科点专项科研基金 (20090014110014 ; 国家高技术研究发展计划(2011AA100201 第一作者 :李静 , 硕士生。

*通信作者 :苏晓华 , 研究员。

E-mail :suxh@caf．ac．cn 。

沈应柏 , 教授。

E-mail :ybshen@bjfu．edu．cn 。

引文格式 :李静 , 张冰玉 , 苏晓华 , 等．植物中的铵根及硝酸根转运蛋白研究进展 [J ]．南京林业大学学报 :自然科学版 , 2012, 36(4 :133－139．植物中的铵根及硝酸根转运蛋白研究进展李静 1, 2, 张冰玉 3, 苏晓华 3*, 沈应柏1, 2*(1．北京林业大学生物科学与技术学院 , 北京 100083; 2．林木、花卉遗传育种教育部重点实验室 , 北京 100083;3．中国林业科学研究院林业研究所 , 国家林业局林木培育重点实验室 , 北京100091摘要 :氮素 (N 是植物需求量最大的营养元素 , 其利用率是影响植物生长和发育的主要因素。

氮素的供需失衡会导致植物产量降低 , 过量施 N 肥还会造成环境破坏。

NH +4和 NO －3是可吸收利用的主要氮源。

笔者分析了植物吸收 NH +4、NO －3的转运蛋白及其相关基因的表达调控和功能的研究进展 , 认为在以后的研究中 , 应加强林木中与氮吸收相关基因的鉴定和认识 , 特别是加强氮素信号传导途径、 NO －3及 NH +4在植物体内的运输和调控机制、各蛋白组分间的相互作用、时间和空间表达模式和调控模式的研究。

毛果杨AGO基因家族生物信息学分析张丽华;王婷;陈群;王晓立;韩浩章【摘要】Argonautes(AGOs)蛋白是生物有机体中普遍存在的一类比较保守的蛋白质,在不同物种的RNAi及相关的途径中具有十分重要的功能,也调控着模式植物拟南芥的生长发育过程.该研究利用AGO蛋白的保守域在毛果杨基因组中进行同源比对,鉴定出毛果杨AGO基因家族成员13个,并对其成员进行了理化性质分析、motif结构比对、进化树构建、基因表达分析等.结果表明:毛果杨AGO基因家族成员基因长度为2463～3189bp,编码的蛋白质具有保守的Piwi、PAZ、DUF1785结构域.PtAGO基因分布于第1、6、8、9、10、12、14、15、16条染色体上,存在着串联重复序列.AGO蛋白定位于叶绿体、细胞核和胞质中,偏碱性和亲水性,具有较高的脂溶指数、不稳定性.基因组织表达分析表明,毛果杨PtAGO成员在不同组织中的表达有明显差异,在与木材形成相关的组织、器官中有较高的表达.【期刊名称】《安徽农学通报》【年(卷),期】2019(025)004【总页数】4页(P12-15)【关键词】毛果杨;AGO蛋白;基因家族;生物信息【作者】张丽华;王婷;陈群;王晓立;韩浩章【作者单位】宿迁学院建筑工程学院实验中心,江苏宿迁 223800;江苏新梦想生态环境建设股份有限公司,江苏宿迁 223800;宿迁学院建筑工程学院实验中心,江苏宿迁 223800;宿迁学院建筑工程学院实验中心,江苏宿迁 223800;宿迁学院建筑工程学院实验中心,江苏宿迁 223800【正文语种】中文【中图分类】S792.11AGO（Argonaute）基因普遍存在于各类生物基因组中，不同生物的AGO蛋白结构相对保守，通常有PAZ和PI⁃WI 2个特征域。

在小RNA分子介导的RNA沉默途径中，AGO蛋白是沉默复合物的主要成分［1］，AGO蛋白可以与这些小RNA介导的不同类型的小非编码RNA结合，特异性结合小RNA互补靶的靶RNA，靶基因被AGO蛋白本身的核酸内切酶活性切割，从而导致靶基因的失活［2］。

毛果杨HDA909基因的克隆与亚细胞定位周桐;翟洪丽【摘要】通过PCR的方法获得毛果杨HDA909基因的编码区序列,分析了HDA909的细胞内分布.结果表明,毛果杨HDA909基因编码是一个由440个氨基酸组成的亲水性蛋白质.亚细胞定位分析表明,HDA909在细胞质和细胞核均有分布,在细胞核定位的信号不很强,主要分布子细胞质中,此为毛果杨HDA909基因的功能分析奠定了坚实的基础.【期刊名称】《林业勘查设计》【年(卷),期】2016(000)002【总页数】5页(P86-90)【关键词】毛果杨;HDA909;亚细胞定位【作者】周桐;翟洪丽【作者单位】黑龙江省森林工程与环境研究所;黑龙江省森林工程与环境研究所【正文语种】中文1.1 实验材料(1)植物材料：野生型毛果杨由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室提供。

(2)菌种与载体：大肠杆菌感受态DH5α(博迈德)； pMD18-T Vector(TaKaRa)；根瘤农杆菌EHA105。

(3)主要试剂：LA-Taq polymerase(TaKaRa)、T4 DNA ligase (TaKaRa) 、DNA Marker DL2000 (TaRaKa) 、质粒(小量)提取试剂盒(O-MEGA) 、胶回收试剂盒(OMEGA)限制性内切酶XbaⅠ(Promega)和KpnⅠ(Promega)，其它试剂为国产分析纯。

1.2 实验方法1.2.1 毛果杨总RNA的提取(1)毛果杨幼苗放于液氮中，在液氮下研磨成粉末；(2)称取0.1 g研磨好的样品放入到0.5 ml冰预冷的TRIZOL中，用漩涡振荡器混匀；(3)将混匀的样品横置5 min；(4)于12000×g、室温离心2 min，将约400μl上清液转移到新的RNase-free 的离心管中；(5)向上清液中加入0.1 ml 5 M的 NaCl，轻缓混匀；(6)加入0.3 ml 的氯仿，漩涡混匀样品；(7)于12000×g、4 ℃离心10 min，取上层水相转移至新的RNase-free 的离心管中；(8)加入等体积的异丙醇，充分混匀，室温放置10 min；(9)于12000×g、4 ℃ 离心10 min；(10)轻轻弃去上清液，向沉淀物中加入800μl 75%的乙醇；(11)于12000×g、4℃ 离心2 min ，弃去液体；(12)于室温自然干燥沉淀，加入20μl DEPC水溶解RNA。

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因家族在杨属种间的分子进化
杨属,作为具有重要经济和生态价值的落叶乔木树种,其分布覆盖整个北半
球树木分布的临界范围。

不同杨属树种基因组全序列的测定,为通过比较关键等位基因的变异来研究不同杨属树种对不同环境的适应机制提供了基础。

本研究以毛果杨基因组为参照序列共设计64对特异性引物,对杨属29个树种Na~+/H~+逆向转运蛋白基因家族(10个基因)进行全长PCR扩增,运用CodonCode Aligner软件对序列数据进行校对;通过PAML计算来检测目的基因是否在不同树种间发生了结构变异和适应性进化;用DnaSP、MEGA和ARLEQUIN等软件进行DNA多态性分析,计算每个种的单倍型遗传多样性,并通过HKA和MKPRF 等软件对数据进行计算和中性检验,揭示Na~+/H~+逆向转运蛋白基因家族在杨
属种间的分子进化机制。

结果表明:白杨组的NHX5基因和胡杨组的NHX6、SOS1基因能够检测到正选择信号;Na~+/H~+逆向转运蛋白家族基因在胡杨和灰杨野生
群体中普遍经历了适应性进化。

同时,研究发现胡杨组的胡杨树种中存在SOS1基因重复现象,将重复基因命名为PeSOS1b,通过功能互补实验发现,胡杨的PeSOS1b基因能够显著恢复缺陷型大肠杆菌EP432(EcNhaA和EcNhaB均缺失)菌株对高盐的敏感性,说明PeSOS1b 基因存在着抗盐功能,尚未假基因化。

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因家族在不同杨
属树种间存在不同的分子进化模式,对于研究基因的进化式样以及阐述相关功能
基因进化的自然选择机制具有重大意义。

植物寡肽运输与硝酸根运输基因家族的研究进展蔡昭艳;刘滔;方中明;范甜;张明永【摘要】氮素是植物生长发育的重要营养元素,也是限制植物生物量尤其是经济产量的关键营养元素之一.植物不仅能从外界获取无机氮素(硝酸根、铵根和尿素等),还能以氨基酸、寡肽等形式获取有机氮素.植物已进化出复杂的运输系统来吸收与运输这些含氮化合物.硝酸根运输基因家族分为低亲和力硝酸根运输基因(low-affmity nitrate transporter fanmily,NRTI)与高亲和力硝酸根运输基因(high-affmith nitrate transporter fanily,NR T2)两类.寡肽运输基因家族分为:运输含2～3个氨基酸残基的寡肽的PTR运输基因家族(peptide transporter family,PTR)和运输4-5个氨基酸残基的寡肽的OPT运输基因家族(oligopeptide transporter family,OPT).其中NRTI与PTR在序列同源性上归属于同一基因家族,称作NRTIIPTR家族.对寡肽运输基因和硝酸根运输基因家族在植物生长发育中的生理、生化功能的研究进展进行了简要综述.【期刊名称】《热带亚热带植物学报》【年(卷),期】2011(019)001【总页数】6页(P91-96)【关键词】硝酸根;寡肽;运输;功能基因;植物【作者】蔡昭艳;刘滔;方中明;范甜;张明永【作者单位】中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室,华南植物园,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室,华南植物园,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室,华南植物园,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室,华南植物园,广州,510650;中国科学院研究生院,北京,100049;中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室,华南植物园,广州,510650【正文语种】中文【中图分类】Q493.2植物生长和发育所必需的矿质元素中，氮素(N)是需求量最大并起着制约植物生长作用的重要元素[1]。