柠檬酸液态发酵及提取工艺

综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。

但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。

二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。

3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。

4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁7水0.025%。

5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、500转条件下发酵4天。

6.分别在0,24,48,72,96小时测定一下参数。

四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。

2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。

3．计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。

一、目前柠檬酸生产过程：基本化学原理：C12H22011 +H20+302→2C6H8O7+4H2O(蔗糖) （柠檬酸）总体来说，柠檬酸的生产主要分为发酵和提取两步。

具体过程如下：步骤：1、原料处理湿粉渣必须经过压榨脱水，使含水量在60%左右；干粉渣含水量低，应按60％的比例补足水分；结块的粉渣需粉碎成二至四毫米颗粒。

2、接种、发酵注意适当通风，因黑曲霉菌是喜空气细菌。

发酵室内的相对湿度注意发酵过程中的温度控制。

（该步骤可浸取得柠檬酸，但此时的柠檬酸清液中含很多其他液态杂质，液态混合物不易分离。

该步骤的生产原理比较简单，即淀粉水解成蔗糖，蔗糖进而与水和氧气生成柠檬酸）该步骤常用产酸能力较强的黑曲霉作为生产菌。

3、清液中和将上一步骤经过沉淀的清液（即含柠檬酸的液态混合物）移入中和罐，加温至60℃后，加入碳酸钙中和，边加边搅拌。

柠檬酸与碳酸钙形成难溶性的柠檬酸钙，从发酵液中分离沉淀出来，达到与其它可溶性杂质分离的目的。

加完碳酸钙后，升温到90℃，保持半小时待碳酸钙反应完成后，倒入沉淀缸内，抽去残酸，再放入离心机脱水，用95℃以上的热水洗涤钙盐，以除去其表面附着的杂质和糖分。

在这里要重点检查糖分是否洗净（洗净的柠檬酸钙盐最好能迅速进行酸解，不要过久贮放，否则会因发霉变质造成损失。

如因故不能及时处理，要晾干后再存放），方法是将1～2%的高锰酸钾溶液滴一滴到20毫升洗水中，3分钟不变色即说明糖分已基本洗净。

在清液中和过程中，控制中和的终点很重要，过量的碳酸钙会造成胶体等杂质一起沉淀下来，不仅影响柠檬酸钙的质量，而且给后道工序造成困难。

一般按计算量加入碳酸钙（碳酸钙总量=柠檬酸总量×0．714），当pH为6．5～7．0，滴定残酸为0．1～0．2％时即达到终点。

一旦加过了碳酸钙量，需要补加发酵或母液。

4、酸解与脱色酸解是将已洗净的难溶性的柠檬酸钙与硫酸作用，生成柠檬酸与硫酸钙。

化学原理如下:Ca(C6H5O7)2+3H2SO4=2C6H8O7+3CaSO4（沉淀）5、浓缩、结晶将脱色后过滤所得清液，用减压法浓缩（要求真空度在600～740毫米汞柱，温度为50～60℃）。

柠檬酸液态发酵及提取工艺综述摘要:发酵有固态发酵、液态浅盘发酵和深层发酵3种方法。

液态浅盘发酵多以糖蜜为原料，其生产方法是将灭菌的培养液通过管道转入一个个发酵盘中，接入菌种，待菌体繁殖形成菌膜后添加糖液发酵。

发酵时要求在发酵室内通入无菌空气。

国内目前有很多人研究了MgCl2、普鲁兰酶、植酸钠、磷浓度、菌种、木薯原料、纤维素糖化液、玉米粉淀粉混合原料、接种量和碳氮比、溶解氧、发酵罐搅拌系统、尿素、乙醇等添加剂、初始含糖量、温度、pH、发酵时间等等对黑曲霉发酵产酸的影响，从而改良提取工艺。

关键词：柠檬酸液态发酵提取工艺一、前言柠檬酸(citric acid）又名枸橼酸，学名2-羟基丙烷三羧酸(2-hydroxytricarboxylic acid)或2-羟基丙烷-l，2，3-三羧酸(2-hydroxy propane-1，2，3-triearboxylic acid)是生物体主要代谢产物之一，在自然界中分布很广，主要存在于柠檬、柑橘、菠萝、梅、李、梨、桃、无花果等果实中，尤以未成熟者含量居多。

分子式：C6H8O7（相对分子质量：192.13），无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，虽有强烈酸味，但令人愉快，稍有涩味。

极易溶于水，溶解度随温度的升高而增大；从结构上讲柠檬酸是一种三羧酸类化合物，并因此而与其他羧酸有相似的物理和化学性质，加热至175°C时它会分解产生二氧化碳和水，剩余一些白色晶体。

柠檬酸是一种较强的有机酸，有3个H+可以电离；加热可以分解成多种产物，与酸、碱、甘油等发生反应。

柠檬酸被称为第一食用酸味剂，极广泛地用作酸味剂、增溶剂、缓冲剂、抗氧化剂等，用于饮料、糖果、酿造酒、冰淇淋、酸奶、罐头食品、豆制品与调味品等的生产中。

另外，在药物、美容品、化妆品工业上也有着重要的应用。

它是香料和饮料的酸化剂，在食品和医学上用作多价螯合剂，同时是化学中间体，用于制造药物，也可用于金属清洁剂、媒染剂等。

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柠檬酸的生产工艺柠檬酸是一种广泛应用于食品、饮料、化妆品等领域的有机酸，具有酸味和清香的特点。

以下是柠檬酸的生产工艺的简要介绍。

柠檬酸的主要生产工艺包括传统工艺和现代工艺两种。

传统工艺:传统工艺主要以柠檬或柠檬皮为原料进行发酵生产。

具体工艺流程如下：1. 预处理: 将柠檬或柠檬皮去皮、去籽，然后切碎或研磨成泥状。

2. 发酵: 将柠檬泥放入发酵罐中，加入一定比例的细砂糖和水，并加入适量的发酵剂，如酵母、酒石酸盐等，进行发酵。

发酵温度一般控制在30-35摄氏度，发酵时间约为2-3天。

3. 分离: 发酵后的混合物经过滤去除固体残渣，得到柠檬酸浸提液。

4. 浓缩: 柠檬酸浸提液经过真空蒸发或浓缩器浓缩，使其浓度达到一定程度。

5. 结晶: 浓缩液经过冷却结晶或结晶沉淀等方式，获得柠檬酸晶体。

6. 过滤: 将柠檬酸晶体进行过滤、洗涤和干燥，得到纯净的柠檬酸成品。

现代工艺:现代柠檬酸生产工艺主要采用微生物发酵生产。

具体工艺流程如下：1. 选种培养: 选用高产柠檬酸的微生物，如亚洲真菌、微生物菌株等进行培养和选种。

2. 培养基制备: 通过混合培养基原料，如糖、酵母粉、蛋白胨、盐等，制备培养基。

3. 发酵: 将选好的微生物种子培养液接入发酵罐中，加入培养基和适量的营养物质，如氮源、磷源、微量元素等，进行发酵。

发酵温度和时间一般根据菌株的要求进行控制。

4. 分离: 将发酵液经过滤或离心分离，得到柠檬酸发酵液。

5. 浓缩: 将发酵液经过真空蒸发或浓缩器浓缩，使其浓度达到一定程度。

6. 结晶: 浓缩液经过冷却结晶或结晶沉淀等方式，获得柠檬酸晶体。

7. 过滤: 将柠檬酸晶体进行过滤、洗涤和干燥，得到纯净的柠檬酸成品。

以上是柠檬酸生产的主要工艺流程，不同生产厂家可能会有一些细微的差异和改进。

现代工艺相对于传统工艺而言更加高效、可控性更强，并且可以实现大规模连续生产，提高了生产效率和产品质量。

柠檬酸的提取过程发酵醪液中含有大量的水、柠檬酸及其他有机酸、淀粉残渣和蛋白质等杂质，需要将柠檬酸从其中提取纯化。

提取纯化工艺有直接提取法和钙盐法两种，应用较多的是钙盐法。

(l)过滤柠檬酸发酵液是固液混合物，固体是菌丝体和不溶于水的物质。

一般采用加压过滤的方法实现固液分离。

常用的是板框过滤和真空抽滤两种方式。

(2)中和在滤液中加入碳酸钙，使其与柠檬酸形成柠檬酸钙盐沉淀，达到与其他可溶性杂质分离的目的。

2C6H8O7.H20+3CaCO3-Ca3(C6H507)2·4H20+3CO2↑+H2O(3)酸解与脱色酸解是将浓硫酸与柠檬酸钙作用，除去硫酸钙及部分酸不溶性杂质，得到柠檬酸溶液的操作。

Ca3(C6H5O7)2.4H2O+3H2S04+4H2O-2(C6H8O7.H2O)+3(CaS04·2H20)脱色是用活性炭或脱色树脂除去有色的物质，常用的是活性炭脱色。

(4)离子交换利用强酸性的阳离子交换树脂，除去柠檬酸液中的各种阳离子。

以钙离子为例：(5)浓缩经离子交换后的柠檬酸液，其含量仅为15%-20%。

需进一步蒸发浓缩，使其结晶析出。

借助加热，将酸中的水分蒸发，以提高酸的浓度。

一般采用减压浓缩，以提高蒸发速度，避免柠檬酸的分解。

(6)结晶浓缩后的柠檬酸液自然降温，冷却水和冷冻盐水降温形成结晶，经离心机甩干，分出母液，滤饼进去干燥。

(7)干燥与包装离心后的柠檬酸晶体含有游离水，需要进一步干燥。

干燥的方式有烘房干燥、沸腾干燥和振动干燥等，常用的是振动干燥。

2002年，天津轻工业学院开发研制出“吸交法”提取柠檬酸新工艺。

该工艺将获得的柠檬酸清液经过“吸交”树脂吸附，使柠檬酸与发酵中的残糖、蛋白质、纤维等杂质分离，再用解脱剂洗脱从而获得较纯的柠檬酸液，再经精制、浓缩、结晶获得成品柠檬酸。

该工艺摆脱了传统的“钙盐法”提取工艺，使提取率提高10%，降低了生产成本和消耗，基本实现了清洁化生产。

柠檬酸的提取工艺
我们知道柠檬酸是食品加工业中很重要的食品添加剂，也广泛应用于医药、染料及其他工业。

柠檬酸生产有两条途径，一条是以淀粉及糖类为原料，用微生物发酵方法来制取；另一条是从含酸分丰富的原料中提取，特别是在果品加工中进行综合利用如制梅胚后排出的咸酸汁液，其含酸量可达4～5%，制柑橘胚后排出的咸酸汁液都是提取柠檬酸很好原料。

其工艺为：
1.原料澄清过滤：橘汁、梅汁中含有不少果胶及杂质，需进行澄清，促进杂质沉淀，然后用压滤机压滤。

2.中和：可用碳酸钙或石灰中和，要预先调成浆状进行，最好加入15%碳酸钙中和。

具体做法是：把橘汁、梅汁等咸酸水加热至75摄氏度时，逐渐加入碳酸钙乳浆，继续加热2小时，初温控制在5摄氏度左右，最后可升高到100摄氏度，至溶液呈青绿色时，即表示已完成中和反应。

然后静置沉淀，此沉淀即为果酸钙（以柠檬酸钙为主）。

3.除盐：所得柠檬酸钙含有盐分，可用清水洗涤，加热至70～80摄氏度，反复多次，直至盐分除净为止，干燥备用。

4.酸解脱色：柠檬酸钙浆液加热至60～70摄氏度，加入浓度为35%的硫酸，沸腾3小时左右，待柠檬酸钙分解完成，即静置沉淀，上层清液为柠檬酸溶液。

将暗红色的柠檬酸用1～2%活性炭脱色半小时，则得无色清液。

5.浓缩、晶析：将无色柠檬酸液进行浓缩，至固形物含
量75%时，于结晶缸内静置结晶。

4～5天可完成晶析。

6.离心、干燥：柠檬酸结晶还含有一定水分和杂质，需用离心机除去。

然后在75摄氏度下干燥到含水量达1%以下，最后通过过筛、分级、包装即为成品。

从发酵液中提取柠檬酸的工艺设计本次实验主要是从黑曲霉发酵液中提取柠檬酸（如图1）。

柠檬酸为无色半透明晶体或白色颗粒或白色结晶性粉末。

其钙盐在冷水中比热水中易溶解，此性质常用来鉴定和分离柠檬酸。

是食品加工业中很重要的食品添加剂，也广泛应用于医药、染料及其他工业。

工业上柠檬酸由蔗糖发酵制得。

黑曲霉、米曲霉均可产柠檬酸。

图1 柠檬酸的结构式1 实验目的采用离子交换色谱法提取柠檬酸。

2 实验材料米曲霉发酵液、701型阴离子交换树脂、732型阳离子交换树脂、活性炭、色谱柱、真空设备、水浴锅、过滤纱布、烧杯、玻璃棒、5%氨水、。

3 实验原理经过过滤的柠檬酸发酵清液通过活性炭脱色，先由阴离子交换柱交换，并用碱(NaOH或NH4OH)进行洗脱，即将交换在树脂上的柠檬酸以柠檬酸钠(或铵)的形式洗脱下来，再由H型阳离子交换剂转型除杂，将柠檬酸钠转为柠檬酸之后，浓缩液结晶，得到高质量的柠檬酸产品。

吸附：3R2NH2OH＋C6H8O7－（R2NH2）3C6H5O7＋ 3H2O洗脱：（R2NH2）3C6H5O7＋3NH4OH－3R2NH2OH＋（NH4）3C6H5O7转型：3R2SO3H＋（NH4）3C6H5O7－3R2SO3NH4＋ C6H8O74 工艺流程图（4）把柠檬酸铵液加入到732型阳离子交换树脂色谱中进行转型处理，得到柠檬酸液。

同样确定各项参数的最佳值，测量洗脱液的体积V2，柠檬酸的浓度C2。

（5）把柠檬酸液转入到烧杯中，放入水浴锅中，低压浓缩。

可以通过查找文献或者自己通过试验来确定水浴温度、真空度、时间的最佳值。

（6）冷却结晶，将浓缩液转入烧杯中，于最适温度下搅拌，待出现晶核，停止搅拌，再移入4度冰箱冷却结晶约t，抽滤获得柠檬酸晶体，烘干后称重柠檬酸质量m。

可以通过查找文献或者自己通过试验来确定温度和冷却结晶时间的最佳值。

（7）纯度检测和确定柠檬酸的回收率。

柠檬酸工艺流程
柠檬酸是一种常见的食品添加剂和工业原料，它广泛应用于食品、饮料、制药、化妆品等行业。

柠檬酸的工艺流程主要包括柠檬汁提取、发酵、提纯等步骤。

首先，柠檬酸的生产需要从柠檬中提取柠檬汁。

选取新鲜的柠檬，经过清洗和去除皮层，然后将柠檬榨汁，得到柠檬汁。

接下来，柠檬汁需要进行发酵的过程。

将柠檬汁加热至40-
45 ℃，然后加入发酵剂。

常用的发酵剂有酵母菌等微生物菌种，他们可以利用柠檬汁中的糖分进行发酵作用。

在发酵过程中，酵母菌会将柠檬汁中的糖分转化为柠檬酸和二氧化碳。

发酵完成后，柠檬汁中的发酵产物与汁液分离。

通常采用过滤法将发酵汁液中的固态废弃物进行分离，得到粗柠檬酸溶液。

接下来，需要对粗柠檬酸溶液进行提纯。

提纯的目的是去除杂质以获得纯度更高的柠檬酸产品。

常用的提纯方法包括浓缩、结晶等。

首先是浓缩，将粗柠檬酸溶液加热浓缩，使溶液中的水分蒸发，浓缩至一定浓度。

然后通过结晶法进行进一步提纯。

将浓缩的柠檬酸溶液冷却，并搅拌以促使结晶过程。

随着温度降低，柠檬酸会逐渐结晶于液体中，形成柠檬酸晶体。

最后，将晶体与母液分离，得到纯柠檬酸。

最后，对柠檬酸进行干燥，使其含水量降低到一定值。

常用的
干燥方法有风干、真空干燥等。

整个柠檬酸的工艺流程通过对柠檬汁进行提取、发酵、提纯和干燥等步骤，最终获得纯度较高的柠檬酸产品。

这种工艺流程简单、高效，能够满足柠檬酸的产量要求，并保证产品的质量。

柠檬酸的生产极大地推动了食品和化学工业的发展，也为人们的生活提供了更多丰富的选择。

综合实验1：柠檬酸发酵及产物提取（一）柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羧生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。

但就柠檬酸产生菌而言，由于其顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：2 C6H12O6 +3 O2→2 C6H8O7 +4 H2O国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。

二、实验器材（一）材料1．菌种：黑曲霉2．蔗糖、硫酸铵等（二）主要仪器设备1．旋转式摇床、超净工作台、15L发酵罐等三、操作步骤1．种子培养基制备：马铃薯培养基配方:(1000ml)马铃薯（去皮）200g葡萄糖（或蔗糖）20g琼脂15~25g水1000ml自然pH2．种子液培养：将已灭菌的种子培养基接入一环斜面孢子于35℃±1℃、250r.p.m条件下培养24~36h。

3．种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100μm，每毫升含菌球数在1~2万之间，无异味、无杂菌污染；pH2~2.5；酸度1.5~2.0%。

4．发酵培养基制备：蔗糖15%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.1%，7水合硫酸镁0.025%。

5. 上罐灭菌（操作同实验一）5．发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的5%接入到已灭菌的发酵培养基中，于35℃±1℃、200r/min条件下发酵4天。

6.分别在0，24，48，72，96小时测定一下参数。

四、实验结果1．对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。

2．测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。