紫外-可见分光光度法标准操作程序1 简述紫外-分光光度法是通过被测物质在特定波长处或一定波长长范围内的吸光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。
本法的在药品检验中主要用于药品的鉴别、检查和含量测定。
定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，然后用对照品或百分吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若化合物本身在紫外光无吸收，而杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰化合物无吸收，则可用本法作检查。
物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生的。
因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。
有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环或发色基团，均可在近紫外区(200-400nm)或可见光区(400-850nm)产生吸收。
通常使用紫外分光光度计的工作波长范围为190-900nm，因此又称紫外-可见分光光度计。
紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。
朗伯－比尔（Lambert-beer）定律为光的吸收定律，它是紫外分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为：Ａ=log1/T=ECL式中Ａ为吸光度；Ｔ为透光率；Ｅ为吸收系数；Ｃ溶液浓度；Ｌ为光路长度。
如溶液的浓度（Ｃ）为1%（g/ml），光路长度(L)为1cm，相应的吸收系数为百分吸收系数，以E表示。
如溶液的浓度(C)为摩尔浓度(mol/L)，液层厚度为1cm时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。
2 仪器紫外-可见分光光度计：主要由光源、单色器，样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。
可见光区全波长范围的测定，仪器备有二种光源，即氘灯-为了满足紫外和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。
单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件、聚焦透镜或反射镜等组成。
色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然石英或熔融硅石制成，对200~400nm波长光的色散能力很强，对600nm以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光谱。
光栅系将反射或透光经衍射而达到色散作用，故常称为衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光束仪器多用光栅为色散元件。
检测器有光电管和光电倍增管二种。
紫外-可见分光光度计依据其结构和测量操作方式的不同可分为单光束和双光束分光光度计二类。
单光束分光光度计有些仍为手工操作，即固定在某一波长，分别测量比较空白、样品或参比的透光率或吸收度，操作比较费时，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但适用于单波长的含量测定。
双光束分光光度计藉扇形镜交替切换光路使分成样品（S）和参比（R）两光束，并先后到达检测器，检测器信号经调制分离为两光路对应信号，信号的比值可直接用记录仪记录，双光束分光光度计操作简单，测量快速，自动化程度高，但作含量测定时，为求准确起见，仍宜用固定波长测量方式。
3 紫外-可见分光光度计的检定3.1 波长准确度3.1.1 波长准确度的允差范围紫外一可见分光光度计波长准确度允许误差，紫外区为±1nm，500nm处±2nm。
3.1.2 波长准确度检定方法3.1.2.1 用低压汞灯检定关闭仪器光源，将汞灯（用笔式汞灯最方便）直接对准进光狭缝，如为双光束仪器，用单光束能量测定方式，采用波长扫描方式，扫描速度“慢”（如15nm/min）、响应“快”、最小狭缝宽度（如0.1nm）、量程0-100%，在200-800nm范围内单方向重复扫描3次，由仪器识别记录各峰值（若仪器无“峰检测”功能，必要时可对指定波长进行“单峰”扫描）。
单光束仪器以751G型为例，可将选择开关放在×0.1位置，透光率读数放在100（或选择开关放在×1，透光率放在10），关小狭缝，打开光闸门，缓缓转动波长盘，寻找汞灯546.07nm峰出现的位置，若与波长读数不符，应调节仪器左侧准直镜的波长调整螺丝，如波长向短波长方向移动，应顺时针方向旋转波长调整螺丝，如向长波方向移动，则应逆时针方向旋转波长调整螺丝，调整好后，再按汞灯的下列谱线测试，记录每条谱线与仪器波长读数的误差。
用于检定紫外可见分光光度计的汞灯谱线波长: 237.83，253.65，275.28，296.73，302.15，313.16，334.15，365.02，365.48，366.33，404.66（紫色），435.83（蓝色），546.07（绿色），576.96（黄色）及579.07nm。
3.1.2.2 用仪器固有的氘灯检定本法主要用于日常工作中波长准确度的核对。
取单光束能量测定方式，测量条件同上述低压汞灯的方法，对486.02及656.10ml 二单峰进行单方向重复扫描3次。
3.1.2.3 用氧化钬玻璃检定将氧化的休玻璃放入样品光路，参比光路为空气，按测定吸收光谱图方法测定。
校正自动记录仪器时，应考虑记录仪的时间常数，测定样品与校正时取同一扫描速度。
氧化钬玻璃在279.4、287.5、333.7、360.9、418.7、460.0、484.5、536、2及637.5nm波长处有尖锐的吸峰值，可供波长检定用。
氧化钬玻璃因制造原因，每片氧化钬的吸收峰波长有差异，另外，在放置的过程中也会发生波长漂移，因此需定期由计量部门校验。
3.1.2.4 用高氯酸钬溶液检定本法可供没有单束光测定功能的双束光紫外分光光度计波长准确度检定用。
高氯酸钬玻璃溶液的配制方法：取10%的高氯酸为溶剂，加入氧化钬配成4%的溶液即得。
）高氯酸溶液有较强的吸收峰波长为241.3、278.10、287.18、333.44、345.47、361.31、416.28、451.30、485.29、536.64、640.52nm。
如果是双束光扫描仪器，但不是数据贮存型的（指的是直接将信号描记于记录纸上），记录的波长可能因记录笔滞后而非真实波长，为了准确测定，建议采用定点检定而不用扫描方式。
3.2 吸光度的准确度精密称取在120℃干燥至恒重的基准重铬酸钾约60mg，置1000ml量瓶中，用硫酸液（0.005mol/L）溶解并稀释至1000ml，用配对的1cm石英池，以硫酸液0.005mol/L为空白，在235，257，313，350nm分别E，测得值应符合下表中规定的允差范围。
测定吸光度，然后换算成波长(nm) 吸收强度吸收系数（E）允差范围235 最小 124.5 123.0-126.0257 最大 144.0 142.8-146.2313 最小 48.6 47.0-50.3106.6 105.5-108.5最大350分辨率、基线平直度、稳定度、绝缘电阻等项检定，按现行国家技术监督局“双光束紫外可见分光光度计检定规程”中华人民共和国国家计量检定规程，应符合有关项下的规定。
日常使用中，对以上两项，即波长和吸光度准确度应根据需要随时检查。
3.3 杂散光的检查可按下表所列的试剂和浓度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在规定的波长处测定透光率，应符合表中的规定。
试剂浓度/%（g/ml）测定用波长/nm透光率＜0.8 220 碘化钠 1.000.8＜3405.00亚硝酸钠 4 样品测定操作方法按各该品种项下规定的方法配制供试品溶 4.1 吸收系数测定（性状项下）项）测定其吸光度，并计算吸收系数，应符合规定液，在规定的波长（参见5.8 范围。
测定供试品溶液在有关波长处的最按该品种项下的规定， 4.2 鉴别及检查大及最小吸收，有的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收与最小吸收的比值，均应符合规定。
4.3 含量测定按各该品种项下规定的方法，分别配制供试品溶液 4.3.1 对照品比较法对照品溶液所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量和对照品溶液，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液10以内用同一溶剂，）%±（的100 的吸光度。
在规定的波长及该 4.3.2 吸收系数法按各该品种项下配制供试品溶液，波长±2nm 处测定其吸光度，按该品种在规定条件下给出的吸收系数计算含量。
，并注意仪器的校正与检定。
如100用本法测定时，吸收系数通常应大于测定新品种的吸收系数，需按后列“吸收系数测定法”的规定进行。
计算分光光度法一般不宜4.3.3 计算分光光度法按规定，《中国药典》应严格按各品种项下规用于含量的测定，对于少数采用计算分光光度法的品种，有一些吸光度是待测成分吸收曲线的上升或下用本法时应注意：定的方法进行。
若故因仔细操作，降的陡坡处测定时，尽量使供试品和对照品的测定条件一致。
，则应在测定前A该品种不用对照品，如维生素测定法（见《中国药典》附录）对仪器作仔细的校正和检定。
．4.3.4 比色法供试品本身在紫外-可见区没有强吸收，或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度，可加入适当的显色剂，使反应物的最大吸收移至可见光区。
用比色法测定时，由于显色时影响显色深浅的因素较多，应取供试品与对照品或标准品同时操作。
除另有规定外，比色法所用的空白系指用同体积的溶剂代替对照品或者供试品溶液，然后依次加入等量的相应试剂，并用同样方法处理。
当吸光度和浓度关系不呈良好线性时，应取数份梯度量的对照品溶液，用溶剂补充至同一体积，显色后测定各份溶液的吸光度，然后以吸光度与相应的浓度绘制标准曲线，再根据供试品的吸光度在标准曲线上查得其相应的浓度，并求出其含量。
5 注意事项5.1 试验中所用的量瓶，移液管均应经检定校正、洗净后使用。
5.2 使用的石英吸收池必须洁净。
用于盛装样品、参比及空白溶液的吸收池，当装入同一溶剂时，在规定波长测定吸收池的透光率，如透光率相差在0.3%以下者可配对使用，否则必须加以校正。
5.3 取吸收池时，手指拿毛玻璃面的两侧，装盛样品溶液以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上面下擦拭干净，检视应无残留溶液，为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用醮有空白溶剂的擦镜纸擦拭，然后再用干擦镜纸拭净。
吸收池放入样品室时应注意每次放入方向相同。
使用后用溶剂及水冲洗干净，晾干防尘保存，吸收池如污染不易洗净时，可用硫酸：硝酸（3:1v/v）混合液稍加浸后，洗净备用。
如用重铬酸钾清洁液清洗时，吸收池不宜在清洁液中长时间浸泡，否则清洁液中的重铬酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面，并应充分用水冲洗，以防铭酸钾吸附于吸收池表面。
5.4 含有杂原子的有机溶剂，通常均具有很强的末端吸收。
因此，当作溶剂使用时，它们的使用范围均不能小于截至使用波长。
列如甲醇、乙醇的截至使用波长为205nm。
另外，当溶剂不纯时，也可能增加干扰吸收。
因此，在检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是否符合要求，即将溶剂置1cm石英吸收池中，以空气为空白（即空白光路中不置任何物质）测定其吸光度，溶剂和吸收池的吸光度应符合下表规定。
