紫外-可见分光光度法

通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差A。
A1
lg
I0 I 1
1bc SB1
A2
lg I0 I 2
2 bc SB2
SB1和SB2分别为在1和2处的背景吸收，当1和2 相近时，背景吸收近似相等。二式相
减，得
A lg
I 1 I 2
A2
A1
(2
1 )bc
这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。
第四章 紫外-可见分光光度法
(ultraviolet visible spectrophotometers)
历史悠久，应用最为广泛的一种光学分析法。 利用被测物质对光的吸收特征和吸收强度，对 物质进行定性、定量分析的一种分析方法。 紫外可见分光光度法是在比色的基础上发展起 来的。
1
第一节 光的吸收定律
灵敏度和检出限 灵敏度（Sensitivity） 指该方法对单 位浓度或量的被测物质的变化所引起 的分析信号值的变化程度。常以标准 曲线的效率衡量。
y a bx
检出限 Limit of detection 指对某一特定方法，在给定的置信
水平内，可以从试样中定性检出待测物 质的最小浓度或量。对于不同的系统， 计算方法不同，即使同一系统，方法不 同，计算方法也不同。IUPAC规定：
二、紫外可见光度计仪器 分光光度计分为单波
长和双波长仪器。
1. 单波长分光光度计 (a) 单光束 (b) 双光束（空间分隔） (c) 双光束（时间分隔）
特点： 因光束几乎同时通过样
品池和参比池，因此可消 除光源不稳产生的误差。
2. 双波长分光度计
单色器
光源
检测器
单Leabharlann Baidu器
切光器 吸收池
双波长分光光度计示意图
光谱定性，有一定的局限性，主要是 分辨率不高，在得到相同的吸收光谱 时，应考虑并非同一物质的可能性， 而两种纯化合物的吸收光谱有明显差 别时，可肯定两化合物不同。
二、定量方法 （一）单组分定量 1. 标准曲线法
A
Ax
cx
c
标准曲线
校准曲线、线性范围和测定限 校准曲线也称校正曲线，是表
示被测物质浓度或量与测定仪器响 应信号值之间的定量关系曲线，包 括工作曲线和标准曲线。
棱镜 是利用不同波长的光具有 不同的折射率而使复合光分开的。用 玻璃和石英制成。
光栅 grating 利用光的衍射和干涉作用使复合光
分开。其特点是：色散波长范围宽，可 用于紫外、可见、红外等光谱区，分辨 率高，色散率基本上不随波长改变而改 变，即均匀色散（色散近于线性）。现 代仪器多用光栅作色栅元件。
溶液浓度c为1 mol/L，液层厚度b为 1cm时的吸光度，用表示。
M 10
E11c%m
和 E11c%m不能直接测得，需用已知准确 浓度的稀溶液测吸光度计算得到。
例：称取1.00mg维生素B12(M=1355)， 配成25.00 ml水溶液，吸收池厚度为
0.5cm，在361nm波长下测得吸光度为
如果在AB范围 内，～1700，CD 范围内～2300， EF范围～2500。 因此，还应考虑单 色光的纯度，即使 用仪器的精确度 （光强和色散元件 的分辨率。
第二节 紫外—可见分光光度计
紫外—可见分光光度计的类型很多， 但其原理基本相似。一般由五部分构成， 即光源、单色器、吸收池、检测器、指 示器（信号显示装置）
一、郎伯-比尔（Lambert-Beer ）定律
1. 透光度和吸光度 当一束单色光通过溶液时，一部
分被吸收，一部分透过溶液，一部分 被容器表面反射。
设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，
透射光强度为It，反射光强度为Ir，则
I0 Ia It Ir
在分光光度分析中，通常将待测溶 液和参比溶液分别置于同样材料和厚度
4. 检测器 将光信号转变为电信号进行检测。
光电管 利用光电效应 的原理。光电流通过负 载电阻R，将电流变成 电压信号，经放大器放 大后，输给记录仪。
暗电流 电极的热电子发射而产生 的电流。暗电流愈小愈好。在分光光度 计中，都设有补偿电路，消除暗电流。
光电管有两种：蓝敏光电管，为铯 阴极，适用波长200～625；红敏管，银 氧化铯，适用波长625～1000
lg T bc
0.614 2.00 103
307
323.15 10
E11c%m
9920
与物质的本性、溶剂和入射光的波长
有关，即
（1）物质不同， 不同，是物质的
特性常数。
（2）溶剂不同，同一物质的不同，
所以应注明溶剂。
（3）不同，同一物质的吸收系数
也不同，所以吸收系数应注明波长；
（4）入射光的纯度：单色光是经单 色器色散成波长范围很窄的光。实际上， 不管单色器的分辨率有多高，所谓的单 色光仍然是有一定的宽度的。例如高锰 酸钾溶液的吸收曲线。
使用时，应进行校正（小于0.5%） 由L—B law可知，当被测物的量一定 时，V越小（c越大），b越大，则A越 大。改进吸收池的形状，使每单位光 程所占的溶液体积尽可能小，即光程/ 体积比即可能大。
常规吸收池 1cm，5ml 1/5=0.2 微型吸收池 ，光程/体积比大于0.2 的为微型吸收池（microcell） b=4cm，V=2，4/2=2
a为吸收系数，是指在一定入射光 波长下，单位浓度及单位液层厚度时 的吸光度。即
a A bc
一般b的单位为cm，a的单位与c的单 位有关。
比吸光系数 specific absorptivity 比吸光系数是指一定波长时，溶
液浓度为1%（w/V），厚度为1cm的
吸光度，用 E11c%m 表示。
摩尔吸光系数 molar absorptivity 摩尔吸光系数是指一定波长时，
转动棱镜或光栅，可使光谱移动，使不同 波长单色光，从出射狭缝射出。
3. 吸收池 absorption cell 比色皿cuvette 盛放样品溶液的容器，用玻璃或石英制 成，两透光面互相平行，具有精确的光 程。紫外区用石英、可见区用玻璃。盛 放参比的吸收池和盛放样品的吸收池应 匹配，即有相同的厚度与透光性。吸收 池的光学面应垂直于光束方向。
Ax=kcx求出cx
cx
cs
Ax As
该法只有在测定浓度范围内遵守 L-B定律，且cx与cs大致相当时，才可 得到准确结果。
（二）多组分定量方法
由于吸光度具有加合性，因此可以在同一 试样中测定多个组份。
设试样中有两组份 a 和 b，将其显色后，分 别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：
Aa2b
光电倍增管
光二极管阵列检测器 photo-diode
array detector
光电二极管阵列检测器是在晶体硅上紧密排列一 系列光二极管，如HP8452A型，在190～820nm， 由316个二极管，当光透过晶体硅时，二极管输 出的电讯号强度与光强度成正比。每一个二极管 相当于一个单色仪的出口狭缝，两个二极管中心 距离的波长范围，称为采样间隔，二极管愈多， 分辨率愈高，每个二极管可在1/10s，每隔2nm测 一次，同时并行采集数据，在1/10s时间内，可 获全光谱。
A2ab
Aab
Aa
Ab
Ab
(
b 1
b 2
)
b
cb
Kcb
在两波长处a组分的吸光度相等 Aa 0 ，
Aa2
Ab2
a
2
lca
b
2
lcb
cb
Aa2b
a
2
lca
l
b
2
1. 解方程组
Aa1b
Aa1
Ab1
a
1
lca
b
1
lcb
Aa2b
Aa2
Ab2
a
2
lca
b
2
lcb
2. 双波长法—等吸收点法
测定b组分时，选择b组分的最大吸收波长作测定波长 1，由b的峰顶向横坐标作垂线与a吸收曲线的一侧相 交，从相交点作横坐标的平行线与a吸收曲线的另一 侧相交，交点所对应的波长为参比波长2 。在1和2 处分别测量吸光度 A1ab与 ，然后相减求 Aab 。
0.414，计算摩尔吸光系数。
解：
0.5
0.414 0.001 1000
2.8 104
L mol1 cm1
(H2O,361nm)
1355 25
例：用纯氯霉素配制100ml含2.00
mg的溶液，在278nm，用1.00cm
的吸收池，测得T=24.3%，求比吸
光系数和摩尔吸光系数。
E11c%m
缝狭
缝狭是单色器的组成部分，对单色光的纯 度起着非常重要的作用。狭缝有两种表示 方法（1）用狭缝的实际宽度表示，以mm 为单位，一般为0～2mm，（2）用通过出 射狭缝的谱带宽度表示，以nm为单位， 如2nm、1nm、0.5nm及0.2nm等。狭缝愈 窄，光的单色性愈好，测得的吸收峰愈尖 锐，但光强度减弱，测定灵敏度降低。
一、分光光度计的主要部件 1. 光源
对光源基本要求：足够光强、稳定、 连续辐射且强度随波长变化小。
钨及碘钨灯：340～2500 nm，多 用在可见光区；
氢灯和氘灯：160～375 nm，多用 在紫外区。
2. 单色器
单色器的用途就是把混合光变成 单色光，由入射狭缝、准直镜、色散 元件、聚焦元件和出口狭缝组成。常 用的色散元件有棱镜和光栅。
T I 10abc I0
为了方便起见：
液层厚度
A lg T lg I0 abc I
吸光度（absorbance）
溶液浓度
吸光系数
A lg T lg I0 abc I
当a、c一定时，A∝b Lambert’s law 当a、b一定时，A∝c Beer’s law
Lambert-Beer 定律可表述为：在一定条件 下，物质的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的 乘积成正比，称为光吸收定律，是吸收光谱定 量的依据。
电荷偶合阵列检测器 charge-coupled device array detector，CCD 5. 信号处理与显示装置
光电管输出的信号很弱，经过放大后才能以某 种方式将测量结果显示出来。信号处理包括一 些数学运算。显示器可由电表、数字显示、荧 光屏显示、结果打印、曲线扫描等。显示方式 有T、A，有的还可以转换成浓度，ε等。
校正曲线的绘制 线性回归，即用最小二乘法求回归方
程 y a bx
使用校正曲线时需注意：
❖ 至少5个点，一般5～10个点，并且应至 少一个数量级范围。
❖ 纵坐标上的最小刻度应与响应值的实际 有效数字相适应。
❖ 尽量使曲线的效率接近1。 ❖ 每次测定样品时应同时绘制标准曲线。
线性范围 测定限 上限、下限
的容器中，让强度为I0的单色光分别通
过两个容器，再测量透射光强度。这样， 反射光的强度基本相同，其影响可以互 相抵消，则
I0 Ia It
当一束单色光通过溶液后，由于吸 收了一部分光能，光的强度就会减弱。
当光透过浓度为c，液层厚度为b 的溶
液时，由于一部分光被吸收，因此
It I0
随着溶液浓度和液层厚度的增加， 光被吸收的程度增加，透射光的强度减 小。透射光强度与入射光强度之比称为 透光度（transmittance），用T表示：
T It I0
例如，入射光的强度为100，透射光 的强度为35，则T = 0.35或35%。
溶液的透光率愈大，表示它对光的 吸收程度愈小；相反，透光率愈小，对 光的吸收程度愈大。
实践证明，溶液对光的吸收程度 与溶液浓度、液层厚度及入射光波长 等因素有关。如果保持入射光不变， 则溶液对光的吸收程度只与溶液浓度 和液层厚度有关，即
Lambert-Beer 定律是均匀、非散 射介质对光吸收的基本定律，只有对 入射光是单色光才完全适用。
偏离比尔定律的因素
主要原因归纳如下： 1. 待测组分的浓度过高 2. 化学反应的影响 3. 谱带宽度过大 4. pH值的影响 5. 杂质的影响 6. 光散射的影响
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2. 吸收系数 absorptivity
对于光谱分析，可测量的最小分析信 号xL为
xL xb ksb
空白试验 多次测量 的平均值
根据一定 置信度确 定的系数
空白试验 多次测量 的标准差
与 xL xb ksb 相对应的浓
度或量即为检出限L
L xL xb ksb
S
S
方法的灵敏度
2. 标准比较法
该法是标准曲线法的简化，即只
配制一个浓度为cs的标准溶液，并测量 其吸 光度 ， 求 出吸 收系 数 k， 然 后 由
特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池
的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。
第三节 分光光度法的定性和定量分析
吸收曲线、max和max，不同的化 合物可能有相同的max，但不可能max 和max完全相同，测max，通常配高、 中、低三种浓度，在max处测A，计算 max，求平均值。