天然药物化学实验讲义目录一、芦荟粗多糖的提取及鉴定二、大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别三、槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别四、八角茴香挥发油的提取及鉴别五、黄柏中生物碱的提取、分离和鉴别六、茶叶中咖啡因的提取前言《天然药物化学实验》是一门实践性很强的课程，理论教学与实验教学是一个不可分割的完整体系。
通过实验课的学习使学生能印证并加深理解课堂讲授的理论知识，掌握由天然药物中提取、分离、精制有效成分，并对其进行鉴别的基本方法和技能，提高学生独立动手、观察分析、解决问题的能力，培养学生严谨的科学态度和良好的科研作风。
实验一芦荟粗多糖的提取及鉴定一、实验目的1、水提醇沉法提取多糖的原理和方法2、掌握高速冷冻离心机、旋转蒸发器等仪器的用法3、了解芦荟多糖在医药中的应用二、实验原理芦荟的多糖类可增强人体对疾病的抵抗力，治愈皮肤炎、慢性肾炎、膀胱炎、支气管炎等慢性病症，抑制、破坏异常细胞的生长的作用，从而达到抗癌目的。
植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖，所以本实验采用水提醇沉法提取芦荟中的粗多糖。
三、试剂、材料及仪器1、试剂：盐酸、无水乙醇、丙酮、乙醚、葡萄糖对照品、苯酚、浓硫酸2、材料和仪器：芦荟叶、烧杯、移液管、量筒、容量瓶、玻璃棒、旋转蒸发仪、电子天平、真空泵、电热恒温水浴锅、紫外-可见分光光度计、高速离心机、真空冷冻干燥机。
四、实验方法与步骤1、取芦荟鲜叶50g，洗净，去掉叶尖和叶底，在蒸馏水水中浸泡0.5h,已除去由表面滲出的黄色液体。
然后切去表皮，将内层凝胶（匀浆后）置于烧杯中，加入三倍蒸馏水，置于55℃恒温水浴锅中加热浸提4h。
2、浸提液离心分离（2500r/min，5min）并过滤（直接6层纱布过滤），将所得液汁减压浓缩（至30ml），用6mol/L的盐酸调pH值3.2左右，向经过调酸处理的芦荟凝胶浓缩汁中缓慢加入6倍量的95％乙醇，边加边搅拌大约需要15～30min，室温下静置2h，离心分离(2500r/min，7min)得多糖沉淀。
依次用乙醇、丙酮和乙醚洗涤，然后真空干燥（通风橱干燥），最终得到的沉淀即为芦荟多糖粗品。
3、芦荟多糖的鉴定对芦荟多糖的鉴定利用改进的苯酚一硫酸法。
苯嘞一硫酸试剂能与芦荟多糖中的己糖起显色反应，在一定波长下其吸光度的变化与多糖含量呈线性关系。
采用苯酚一硫酸显色法鉴定芦荟多糖，芦荟中的多糖在硫酸的作用下，先水解成单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，然后和苯酚缩合成有色化合物共轭酚在490nm处有最大波长，由此可以鉴定出芦荟中的多糖(图1)。
五、注意事项加入乙醇沉淀多糖时要边加边搅拌，时间要长一些；六、作业与思考题1、记录实验条件，过程和实验现象。
2、为什么要在醇沉之前调pH值？实验二大黄中蒽醌苷元的提取、分离与鉴别【实验目的】1.掌握从大黄中提取和分离游离蒽醌的方法。
2.掌握用pH梯度萃取法分离不同酸性的羟基蒽醌类化合物。
3.掌握蒽醌类化合物的主要检识方法。
4.熟悉蒽醌类化合物的色谱检识方法。
5.了解用柱色谱法分离蒽醌类成分。
【实验原理】1.大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄R.tanguticum Maxim.ex Reg.和药用大黄R. officinale Baill.的干燥根及根茎。
大黄中含有大黄蒽醌及其苷。
（1）大黄酸(rhein) 分子式C15H8O6，分子量284.21。
黄色针状结晶（升华法），mp.321～322℃，330℃分解。
能溶于碱水、吡啶，溶于乙醇、氯仿、乙醚和石油醚，几不溶于水。
（2）大黄素(emodin) 分子式C15H10O5，分子量270.23。
橙色针状结晶(乙醇)，mp.256～257℃，能升华。
易溶于乙醇、碱水，微溶于乙醚、氯仿，几不溶于水。
（3）芦荟大黄素(aloe-emodin) 分子式C16H10O5，分子量270.23。
橙色针状结晶（甲苯），mp.223～224℃。
易溶于热乙醇，可溶于乙醚和苯，并呈黄色；溶于碱液呈红色；氨水及硫酸中呈绯红色。
（4）大黄酚(chrysophanol) 分子式C15H10O4，分子量254.23。
橙黄色六方形或单斜结晶（乙醇或苯），mp.196～197℃，能升华。
易溶于沸乙醇，可溶于丙酮、氯仿、苯、乙醚和冰醋酸，极微溶于石油醚、冷乙醇，几不溶于水。
（5）大黄素甲醚(physcion) 分子式C 16H 12O 5，分子量284.26。
砖红色单斜针状结晶，mp.203～207℃，溶于苯、氯仿、吡啶及甲苯，微溶于醋酸及醋酸乙酯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮。
2.本实验是根据大黄中的羟基蒽醌苷经酸水解成游离羟基蒽醌，而游离羟基蒽醌不溶于水，可溶于氯仿、乙醚等亲脂性有机溶剂的性质，用氯仿从水解液中将游离羟基蒽醌提取出来，再利用各游离羟基蒽醌的酸性不同，采用pH 梯度萃取法将其分离。
其中大黄酚和大黄素甲醚的酸性十分近似，用pH 梯度萃取法难以分离，可利用两者的极性不同，采用硅胶柱色谱法进行分离。
【实验仪器与试剂】1.索氏提取器，500、100、10ml 烧杯，1000、500ml 分液漏斗，10ml 试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，水浴锅，10×20cm 薄层板，10×20cm 薄层色谱缸，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机，层析柱（Ф1.5cm ）2.大黄粗粉，滤纸，pH 试纸，乙酸乙酯，石油醚（60～90℃），氯仿，20％硫酸，pH8缓冲液，pH9.9缓冲液，浓盐酸，5％碳酸钠，5％氢氧化钠，丙酮，0.5%醋酸镁乙醇试剂，薄层用硅胶H ，0.2%CMC-Na ，甲醇，大黄酸、大黄素、芦荟大黄素对照品，展开剂：石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液，浓氨水。
大黄酚 R 1=CH 3 R 2=H 大黄素 R 1=CH 3 R 2=OH 大黄酸 R 1=COOH R 2=H 大黄素甲醚 R 1=CH 3 R 2=OCH 3 芦荟大黄素 R 1=CH 2OH R 2=HO O OH R 2OHR 1【实验步骤】1. 提取与分离大黄粗粉100g水洗余酸至中性乙酸乙酯、石油醚提取液盐酸调pH3，静置，滤过萃取沉淀冰醋酸精制乙酸乙酯、石油醚提取液碱水层大黄酸盐酸调pH3，滤过沉淀丙酮精制大黄素乙酸乙酯、石油醚提取液碱水层萃取盐酸调pH3，滤过沉淀碱水层乙酸乙酯、石油醚提取液醋酸乙酯精制盐酸调pH3，滤过芦荟大黄素沉淀2．检识（1）碱液试验分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴10％氢氧化钠试剂振摇，观察颜色变化，羟基蒽醌应显红色。
（2）乙酸镁试验分别取各蒽醌化合物结晶少许，置试管中，加1ml乙醇溶解，加数滴0.5％乙酸镁乙醇试剂，观察颜色变化，羟基蒽醌应显橙、红、紫等颜色。
（3）薄层色谱检识薄层板：硅胶H-CMC-Na试样：自制大黄酸、大黄素、芦荟大黄素的乙醇溶液。
对照品：上述各成分对照品乙醇溶液（约1mg/ml）。
展开剂：石油醚（30～60℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）上层溶液。
显色：在可见光下观察，记录黄色斑点的位置。
然后再用浓氨水熏蒸或喷雾5％乙酸镁甲醇溶液，斑点应显红色。
【基本操作注意事项】1.大黄中蒽醌类化合物的种类、含量与大黄的品种、采集季节、炮制方法及贮存时间均有关系，实验用药材应注意。
2.萃取用pH8缓冲液为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；pH9.9缓冲液为碳酸氢钠-碳酸钠缓冲液。
配制好的缓冲液要测pH值。
一般萃取大黄酸用pH7～8范围的，萃取大黄素用pH9.5～11范围的。
3.用各缓冲液进行萃取时，采用一次性加入的方法，实验证明，如将缓冲液分次萃取，分离效果不理想。
4.本实验也适应于以虎杖为原料的提取，但虎杖中不含大黄酸，故直接由大黄素开始分离。
5.色谱分离大黄酚及大黄素甲醚时，先用氯仿洗脱至出现黄色色带时，改用氯仿—醋酸乙酯（8∶2）混合溶剂继续洗脱，并更换收集器，每10ml为一份，按顺序编号，直至色谱柱的第一色带全部洗脱下来为止。
各流分经硅胶-CMC-Na板，氯仿－醋酸乙酯(8∶2)展开，用大黄酚和大黄素甲醚作对照，合并斑点相同流分，分别浓缩、放置析晶，即可获得大黄酚及大黄素甲醚。
【思考题】一、大黄游离蒽醌的提取分离方法还有哪，同时注意实验成本、仪器、安全、环保等多因素思考。
二、（1）大黄中5种羟基蒽醌化合物的酸性和极性大小应如何排列？为什么？（2）pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中药成分的分离？（3）蒽醌类化合物及其苷的薄层色谱用什么作吸附剂、展开剂和显色剂？（4）蒽醌类与乙酸镁显色反应的必要条件是什么？其颜色反应与羟基所在的位置有何关系？实验三槐米中芦丁、槲皮素的提取、分离与鉴别【实验目的】1.掌握黄酮类化合物的提取原理和方法。
2.掌握黄酮类成分的主要理化性质及鉴别方法。
3.熟悉和了解采收与炮制对芦丁含量的影响。
【实验原理】1.槐花为豆科植物槐Sophora japonica L．的干燥花及花莆。
前者习称槐花Flos Sphorae；后者习称槐米Flos Sophorae Immaturus。
主产于河北、山东、河南、陕西、江苏、广东、广西、辽宁等地。
以河北、山东、河南产量大。
性能：苦，性微寒。
功效：凉血止血、清肝泻火。
应用：用于便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等。
2.主要含有芦丁（芸香苷）、槲皮素，还含少量皂苷类及多糖、粘液质等。
近代研究表明槐米含芦丁可高达23.5%，槐花开放后降至13.0%。
芦丁可用于治疗毛细血管脆性引起的出血症，并用作高血压辅助治疗剂。
芦丁还可以作为制备槲皮素、羟乙基槲皮素、羟乙基芦丁、二乙胺基乙基芦丁等的原料。
3.芦丁为浅黄色粉末或极细微淡黄色针状结晶，含3分子结晶水（C27H30O16·3H2O），加热至185℃以上熔融并开始分解。
芦丁的溶解度，在冷水中1:10000，沸水中1:200，沸乙醇中1:60，沸甲醇中1:7，可溶于乙醇、吡啶、甲酰胺、甘油、丙酮、冰醋酸、乙酸乙酯中，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚。
芦丁分子中具有较多酚羟基，显弱酸性，易溶于碱液中，酸化后又可析出，因此可以用碱溶酸沉的方法提取芦丁。
【实验仪器与试剂】1.1000、500、100、10ml烧杯，10ml试管，试管架，托盘天平，量筒，三角漏斗，洗瓶，布氏漏斗，电炉，10×20cm薄层板，10×20cm薄层色谱缸，色谱专用滤纸，聚酰胺色谱膜，点样毛细管，紫外灯（仪），玻棒，牛骨匙，纱布，脱脂棉，显色剂喷瓶，小型空压机。
2.槐花米粗粉，滤纸，pH试纸，生石灰，硼砂，2%硫酸，浓硫酸，稀盐酸，浓盐酸，10%氢氧化钠，乙醇，10%α-萘酚乙醇溶液，镁粉，1%醋酸镁甲醇溶液，1%三氯化铝乙醇溶液，2%二氯氧锆甲醇溶液，2%枸橼酸甲醇溶液，Ba(OH)2，滑石粉，甲醇，氨水，芸香苷、槲皮素、葡萄糖、鼠李糖对照品，展开剂：正丁醇-乙酸-水（4:1:5）上层溶液（纸色谱），90%乙醇或乙醇-水（7:3）（聚酰胺色谱），显色：苯胺-邻苯二甲酸盐试剂。
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