免疫荧光细胞化学染色方法

细胞免疫荧光染色多色顺序细胞免疫荧光染色是一种重要的实验技术，它可以帮助科学家们观察和研究细胞内特定蛋白质的分布情况。

而多色顺序则是指在同一细胞中使用多种荧光染料进行染色，以便同时观察不同蛋白质的位置和相互关系。

下面我将以第一人称的方式，为你详细介绍细胞免疫荧光染色多色顺序的过程。

我们需要准备好实验所需的材料和试剂。

这包括细胞培养皿、细胞培养基、荧光染料、PBS缓冲液、固定液、渗透液、封片液等。

确保这些材料都是干净、无菌的，并按照实验要求进行保存和处理。

接下来，我们需要将细胞培养在培养皿中。

在培养基中加入适量的细胞，然后将培养皿放入恒温培养箱中进行培养。

确保细胞的生长状态良好，并具备足够的数量用于后续实验操作。

当细胞生长到适当的密度后，我们可以开始进行细胞免疫荧光染色实验了。

首先，我们需要将细胞固定在培养皿中，以保持它们的形态和结构。

使用固定液进行固定，并按照实验要求的时间进行固定反应。

固定完成后，我们需要进行渗透处理，以便荧光染料可以更好地进入细胞内部。

使用渗透液进行渗透处理，时间和温度根据实验要求进行控制。

渗透处理完成后，我们可以进行荧光染色了。

根据实验设计，选择合适的荧光染料，将其稀释到适当的浓度，并将其加入到细胞培养皿中。

确保每种染料的加入都是分开进行的，以避免不同染料之间的相互影响。

荧光染色完成后，我们可以进行显微镜观察了。

使用荧光显微镜，调节合适的波长和滤光片，以观察和记录不同荧光染料在细胞中的分布情况。

同时，还可以使用图像处理软件对显微镜拍摄的照片进行分析和处理，以提取更多有用的信息。

细胞免疫荧光染色多色顺序的实验过程如上所述。

通过这种方法，我们可以同时观察多种蛋白质在细胞中的位置和相互关系，为我们研究细胞的结构和功能提供了重要的工具和手段。

在实验过程中，我们需要严格控制各个步骤的条件和时间，以确保实验结果的准确性和可靠性。

同时，还需要注意实验中的安全操作，避免对人体和环境造成危害。

免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。

该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。

本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。

一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。

在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。

这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。

直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。

这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。

间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。

这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。

但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。

二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。

例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。

预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。

2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。

3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。

4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。

5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。

三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。

以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。

2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。

免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法（1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡（2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

（3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min（4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。

（6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

（7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。

（8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

（9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。

（10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。

（11）次日取出切片，室温下复温 30min。

（12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。

（13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。

（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。

（15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。

（17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。

（18）使用荧光显微镜进行观察拍照。

贴壁细胞免疫荧光法（1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min（2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min（3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。

（4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min（5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。

（6）1%BSA室温封闭30min（7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。

免疫荧光三色染色步骤免疫荧光三色染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测和定位细胞或组织中的特定抗原。

通过使用三种不同的荧光染料，可以同时检测三种不同的抗原，从而在同一样本中获得更多的信息。

下面是免疫荧光三色染色的步骤：1. 样本处理：首先需要准备好待检测的细胞或组织样本。

可以通过固定、切片和脱脂等步骤来处理样本，以便于荧光染料的渗透和抗原的暴露。

2. 抗原修复：某些细胞或组织中的抗原可能会经历一定程度的损伤或变性，需要进行抗原修复以恢复其免疫反应性。

常用的抗原修复方法包括热处理、酶解和化学修复等。

3. 阻断非特异性结合：为了避免荧光染料的非特异性结合，需要使用适当的阻断剂来防止非特异性结合。

常用的阻断剂包括牛血清蛋白、小鼠或兔子血清等。

4. 一抗染色：选择合适的一抗，加入到样本中与目标抗原结合。

一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，根据实验的需要选择合适的一抗。

5. 二抗染色：二抗是与一抗结合的抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔的抗体。

二抗上标记有荧光染料，常见的有荧光素、荧光素同工酶和荧光素同工酶等。

6. 染色显色：将标记有荧光染料的二抗加入到样本中，与一抗所结合的抗原发生特异性反应，形成荧光染色的复合物。

7. 洗涤：染色完成后，需要进行多次洗涤以去除未结合的抗体和荧光染料，减少背景信号的干扰。

8. 封片：将处理好的样本用适当的封片剂封装在载玻片上，然后使用适当的封片胶或胶带固定样本。

通过以上步骤，可以实现免疫荧光三色染色的目的。

这种技术可以在细胞或组织中同时检测和定位多种抗原，为科研工作者提供更多的信息和数据。

需要注意的是，在进行免疫荧光三色染色时，要选择合适的一抗和二抗，以及荧光染料的激发和发射波长。

此外，还需要进行严格的实验控制，包括阴性对照和阳性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。

免疫荧光三色染色技术在生命科学研究中具有广泛的应用，可以用于研究细胞分子机制、疾病诊断和治疗等方面。

随着技术的不断发展和改进，相信免疫荧光三色染色技术将在未来的研究中发挥更大的作用。

常用免疫组织化学染色方法免疫组织化学染色是通过将抗原与抗体结合来检测组织中特定蛋白质的染色方法。

它是现代生物医学中常用的一种技术，可以用于研究分子生物学、细胞生物学、病理学等领域。

以下是一些常用的免疫组织化学染色方法介绍：1. 免疫组化染色(Immunohistochemistry, IHC)：免疫组化染色是免疫组织化学中最常用的方法之一、其基本原理是使用一种与目标抗原特异性结合的抗体，将抗原与抗体结合，然后通过染色方法将表达该抗原的细胞或组织可视化。

常用的染色剂包括多聚酶、酶标、荧光素和放射性同位素。

IHC可以用于检测细胞表面抗原、细胞器中的抗原以及胞内蛋白质的定位。

2. 免疫荧光染色(Immunofluorescence, IF)：免疫荧光染色利用荧光标记的抗体来检测特定抗原。

它可以提供高度特异性和灵敏度的探测，可以用于研究蛋白质的亚细胞定位、蛋白质相互作用等。

利用该方法可以用于检测多种类型的标记（单标记、双标记、复合标记等），从而实现多重染色或共定位染色。

3. 免疫电镜染色(Immunoelectron microscopy, IEM)：免疫电镜染色是一种将金粒标记的抗体用于电子显微镜下观察并定位特定抗原的方法。

通过将金粒结合到抗原-抗体复合物上，可以在电子显微镜下清晰地观察到抗原的位置和分布。

这种方法具有高分辨率和高特异性的优点，广泛应用于超微结构的研究。

4. 免疫酶标染色(Immunoenzyme staining, IES)：免疫酶标染色是使用酶作为标记物，通过化学反应将抗原与酶标记的抗体结合，从而显示出特定抗原的位置和分布。

常用的标记物包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。

在检测抗原时，标记物可以与染色底物产生反应生成可见色素，形成染色，以显示抗原的位置和分布。

5. 免疫组织化学原位杂交(Immunohistochemical in situ hybridization, IHC-IS)：免疫组化原位杂交技术是一种结合了原位杂交和免疫组化技术的方法。

免疫荧光组织（细胞）化学染色方法免疫荧光组织（细胞）化学染色方法：直接法基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。

缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸H37℃温箱等。

试验步骤1、滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持肯定湿度。

2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全掩盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温肯定时间（参考：30min）。

3、取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按挨次过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片掩盖。

5、马上用荧光显微镜观看。

观看标本的特异性荧光强度，一般可用"+'表示：（-）无荧光；（）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清晰可见；（++）荧光光明；（+++ --++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达"++'以上，而各种对比显示为（）或（-），即可判定为阳性。

留意事项1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有肯定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观看。

2、染色的温度和时间需要依据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。

不通透的染色方法:封闭液:3%BSA 用PBS 配制不加吐温-20,一抗,二抗用封闭液配制.1.4% PFA（多聚甲醛）室温固定15min。

2.1xPBS 洗三次，每次5min。

3.3%BSA（不加吐温-20）封闭1hr。

4.一抗4度过夜5.1xPBS 洗三次，每次5min。

6.二抗37度2hr。

7.1xPBS 洗三次，每次5min。

8.DAPI 染色5min。

9.1xPBS 洗三次，每次5min。

蔺红方法染色：蔺红用的方法封闭液里不加土温20 。

我们模拟这个方法封闭液里加了土温20。

1.4% PFA（多聚甲醛）固定15min。

2.1xPBS 洗三次，每次5min。

3.0.2% tritonX-100 通透15min。

4.1xPBS 洗三次，每次5min。

5.3%BSA封闭0.5hr。

6.一抗4度过夜。

7.1xPBS 洗三次，每次5min。

8.二抗37度1hr。

9.1xPBS 洗三次，每次5min。

10.DAPI 染色5min。

11.1xPBS 洗三次，每次5min。

12.封片。

通透的染色方法:封闭液: :3%BSA 用PBS 配制，加千分之一吐温-20一抗，二抗用封闭液配制。

1、细胞铺板，处理2、弃上清，甲醇-20℃固定10min3、预冷的1X PBS 冲洗两遍4、0.2% NP40(PBS配)室温通透8min5、1X PBS 洗5min X 3次6、1%BSA(PBS+1千分之一的土温20配) 室温封闭40min7、一抗4℃（1%BSA配制）孵育过夜8、1X PBS 洗5min X 3次9、二抗（1%BSA配制）室温避光孵育1h10、1X PBS 洗5min X 3次，拍照。

免疫荧光技术：染色方法（一）制片选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙醚等量混合液中。

用时取出用绸布擦净。

将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。

也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。

（二）固定除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。

固定的作用有三：①防止标本从玻片上脱落；②除去防碍抗原—抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果；③固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20℃下可保存一年而不改变其染色特性。

标本的固定原则是：①不能损伤细胞内的抗原；②不能凝集蛋白质；③不能损伤细胞形态；④固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。

（三）水洗固定后以冷的0.01Mol/L pH7.4PBS液浸泡冲洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

（四）染色染色分直接染色法与间接染色法。

1．材料与试剂（1）荧光抗体，稀释至应用浓度。

（2）0.01Mol/L pH7.4PBS液（3）9份优质甘油加1份pH7.4PBS液即为甘油缓冲液。

甘油有减少非特异性荧光的作用。

（4）带盖方盘2．直接染色法（1）将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37℃感做30 min～45min。

（2）PBS冲洗3次，每次冲洗3min，即3×3ˊ冲洗。

（3）蒸馏水冲洗。

（4）滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。

2．间接染色法（1）检查抗原：①取固定标本，加已知的免疫血清，37℃孵育30min；②以PBS 液3×3ˊ冲洗；③再加荧光标记的抗抗体，37℃孵育30min；④PBS 3×3ˊ冲洗；⑤H2O冲洗，凉干；⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。

检查抗体：①以免疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定；②滴加相应抗原液（按1﹕100～1﹕500稀释），37℃孵育30min；③PBS液3×3ˊ冲洗；④加荧光抗体，37℃孵育30min；⑤PBS液3×3ˊ冲洗；⑥水洗，凉干；⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。

免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法，又称免疫细胞化学，是一种常用于检测生物组织或细胞中特定抗原的方法。

该方法基于抗体和抗原的特异性结合，通过标记荧光物质使抗原在显微镜下可见，从而实现对抗原的定位和分析。

免疫荧光法在医学诊断、生物研究和疾病治疗方面具有广泛的应用。

免疫荧光法主要有间接免疫荧光法和直接免疫荧光法两种常用的技术路线。

在间接免疫荧光法中，首先与待检测物质结合的主抗体通过蛋白A或其他特异性标记物结合于抗体上，然后将荧光染料标记的二抗与主抗体结合。

而在直接免疫荧光法中，待检测物质直接与荧光染料标记的主抗体结合。

免疫荧光法具有以下特点和优势。

首先，该方法可以实现高度特异性的抗原-抗体结合，提供了对生物组织或细胞中特定分子的具体定位。

其次，免疫荧光法能够同时检测多个抗原，通过使用不同的荧光染料标记不同的抗体。

这种多重染色技术为研究者提供了同时观察多种分子相互作用和定位的能力，有助于深入了解生物进程。

此外，免疫荧光法对样本的要求较低，可以应用于多种类型的样本，包括细胞培养、组织切片和体液等。

免疫荧光法在多个领域中发挥重要作用。

在医学诊断中，它常用于检测感染病原体、肿瘤标志物和自身免疫性疾病等。

例如，通过特定抗体的荧光染色，医生可以确定细菌或病毒是否存在，并根据染色的位置和强度进行病理诊断。

在生物研究中，免疫荧光法广泛应用于蛋白质定位、细胞信号传导和分子相互作用的研究。

此外，免疫荧光法还常被用于疫苗研发和疾病治疗中，通过精确定位抗原和荧光下标记药物，为新药的研发打下基础。

总之，免疫荧光法作为一种重要的实验技术，凭借其高度特异性、多重染色和样本适应性等优势，为生物学研究、医学诊断和药物开发提供了强有力的工具。

不断的技术创新和方法改进将进一步推动免疫荧光法在各个领域的应用，并为深入理解生物系统和疾病机理提供重要支持。

免疫荧光组织（细胞）化学技术：如何设置对照（直接法、间接法和
为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，
必须在初次试验时设置对照：
1、直接法
（1）标本自发荧光对照
标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称
为自发荧光。

（2）抑制试验
可分为一步方法和二步方法。

一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，
再加在标本上染色，结果应为阴性。

二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光
抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。

（3）阳性对照
用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色，结果应呈阳性荧光。

如对照1和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。

2、间接法
（1）自发荧光对照：同直接法。

（2）荧光抗体对照：标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。

（3）抑制试验：同直接法。

（4）阳性对照：同直接法。

结果：如对照（1）、（2）、（3）均呈阴性，阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光。

3、补体法
（1）自发荧光对照
（2）荧光抗体对照
（3）抑制试验
（4）补体对照：取新鲜豚鼠血清1:10稀释，先作用于标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。

（5）抑制试验：标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释
液，结果应为阴性。

（6）阳性对照。

（1）~（5）结果阴性，（6）待检标本阳性时，则为特异性荧光。

免疫荧光染色实验步骤1.细胞处理：将需要进行染色的细胞培养于培养皿中，通常使用生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以去除培养基或其它细胞残留物。

2.固定：使用适当的固定剂，如甲醛或乙醛，固定住细胞。

通常在室温下固定细胞10-30分钟，然后用PBS洗涤。

3.渗透化处理：为了增强抗原与抗体的结合，需要使用渗透化剂如BSA（牛血清白蛋白）或胎牛血清等，封闭其它非特异结合位点。

浓度通常为1-5%的BSA，可以根据实验需要调整。

4.预处理：通过预处理，可以增强抗原的可见性。

预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。

具体方法应根据需要选择。

5.抗原特异性溶液：将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养皿中，使其与抗原结合。

抗体通常与标记物如荧光染料共价结合，使得标记的抗原能够被荧光显微镜观察。

6.清洗：将细胞用PBS洗涤，以去除未与抗体结合的游离抗体。

7.荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。

荧光显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片，可以选择和激发不同荧光染料的发光。

根据需要，可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。

8.影像分析：通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进行分析和量化。

常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。

9.结果解读：根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。

可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。

补充说明：2.正、阴对照：在进行抗原染色前，应设置正、阴对照实验。

正对照是指使用已知表达目标抗原的样本，而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。

通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。

3.染色条件优化：染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。

因此，需要对染色条件进行优化，以确保得到准确的结果。

4.扩展检测：除了直接染色，还可以使用间接染色方法来增强信号。

通过使用辅助抗体，可以将多个标记物同时进行检测，提供更多的信息。

总结起来，免疫荧光染色实验步骤是：细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。

四种抗体免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色听起来就很厉害的样子呢，其实操作起来也没有特别难啦。

一、样本准备。

咱得先把要染色的样本处理好哦。

如果是细胞样本的话，要把细胞好好地培养在载玻片或者盖玻片上，让它们长得美美的，可不能有太多杂质或者状态不好。

要是组织样本呢，就得把组织切成薄片，这个切的时候可得小心啦，就像对待小宝贝一样。

二、固定。

固定这个步骤超重要的。

一般用多聚甲醛来固定样本，把样本泡在里面一段时间，就像给细胞或者组织来个“定身术”，让它们保持原来的样子，这样后面染色的时候才不会变形。

这个时间要掌握好哦，太久或者太短都不太好。

三、通透。

接下来就是通透啦。

用一些通透剂，像Triton X - 100之类的，让抗体能够顺利地进入细胞里面去找到它们要结合的目标。

这就像是给抗体开了个小通道，让它们能自由穿梭。

四、封闭。

封闭就像是给样本穿上一层保护衣。

用正常血清或者牛血清白蛋白之类的东西把样本上那些非特异性结合的位点给占住，这样抗体就不会乱结合啦，只会乖乖地去找自己的目标。

五、一抗孵育。

现在轮到一抗上场啦。

把我们准备好的四种抗体按照合适的比例稀释好，然后加到样本上。

这个时候样本就像是一个小舞台，一抗们就开始在上面寻找自己的舞伴（抗原）啦。

孵育的时间也要注意，要让它们有足够的时间去结合。

六、洗涤。

一抗孵育完了，就得把没结合上的一抗给洗掉，就像打扫舞台一样，只留下那些成功结合的一抗。

用缓冲液轻轻冲洗样本，多洗几次，这样才能保证后面的结果准确。

七、二抗孵育。

二抗是带着荧光标记的哦。

把二抗按照比例稀释后加到样本上，二抗就会去找一抗，然后紧紧地抱住它。

这时候就像给一抗穿上了一件会发光的衣服，超酷的。

八、再次洗涤。

和之前一样，把多余的二抗给洗掉，让舞台又变得干干净净的。

九、封片。

最后一步就是封片啦。

用封片剂把样本封起来，这样样本就可以好好保存，等着我们去观察它在荧光显微镜下的美丽模样啦。

免疫荧光染色就这么一步步来，每一步都很关键，就像搭积木一样，少了一块都不行呢。

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。

2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。

4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。

5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。

6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。

8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。

10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。

11.次日取出切片，室温下复温30分钟。

12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。

14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。

16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。

18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。

贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。

2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。

3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。

5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

6.使用1% BSA室温封闭30分钟。

7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。

8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。

免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。

免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。

(7)荧光显微镜观察拍照。

细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。

免疫荧光细胞化学染色方法免疫荧光细胞化学染色是一种常见的细胞分析方法，通过使用荧光标记的抗体来检测特定蛋白质在细胞中的表达情况。

该方法不仅能够检测蛋白质在细胞中的定位，还能提供关于蛋白质功能和相互作用的信息。

在本文中，我将详细介绍免疫荧光细胞化学染色方法的步骤、原理和应用。

免疫荧光细胞化学染色方法的步骤主要包括：样品处理、抗体染色、显微镜观察和图像分析。

首先，需要准备和处理细胞样品，通常包括固定和渗透化步骤。

这些步骤有助于维持细胞的形态和结构，并使细胞膜通透性增加，这样抗体才能够进入细胞内结合特定的蛋白质。

然后，将荧光标记的一抗添加到细胞样品中，并进行适当的孵育时间，使抗体能够与目标蛋白质结合。

接下来，在洗涤步骤中，需要将未结合的抗体和其他非特异性结合物清洗掉。

最后，在显微镜下观察样品，并使用图像分析软件进行定量分析。

免疫荧光细胞化学染色方法的原理基于抗原-抗体反应和荧光标记。

抗体是一种特异性结合到特定抗原的蛋白质。

在免疫荧光细胞化学染色中，抗体与目标蛋白质结合后，可以用荧光标记的二抗来准确检测该结合。

荧光标记的二抗可以与一抗结合，从而使目标蛋白质以荧光标记的形式可视化。

这样，可以在显微镜下用合适的光源激活荧光标记，然后通过滤光片选择性地观察和分析特定波长的荧光。

免疫荧光细胞化学染色方法在生物医学研究中具有广泛的应用。

一方面，它可以用来研究细胞的蛋白质定位和表达水平。

通过将不同荧光标记的抗体用于细胞中的不同蛋白质，可以同时观察多个蛋白质的表达情况和相互作用。

另一方面，这种方法还可以用于研究疾病的发生和发展机制。

通过比较正常细胞和病变细胞中蛋白质的表达差异，可以找到潜在的疾病标志物，并为疾病诊断和治疗提供重要的依据。

总结起来，免疫荧光细胞化学染色方法是一种重要的细胞分析技术，可以用于研究细胞的蛋白质表达、定位和相互作用。

通过使用荧光标记的抗体，可以准确地检测特定蛋白质的表达情况，并提供有关蛋白质功能和相互作用的信息。

笔记：免疫荧光
本篇文章由专业生化试剂供应商上海岚兴生物为您提供.
免疫荧光又称免疫荧光抗体。

免疫荧光实验原理是将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。

利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

下面详细介绍免疫荧光染色步骤：
1. 滴加 0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间(参考：30min)。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 冲洗后，再按顺序过 0.01mol/L，pH7.4 的 PBS 三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：(-)无荧光；(±)极弱的可疑荧光；(+)荧光较弱，但清楚可见；(++)荧光明亮；(+++--++++)荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为(±)或(-)，即可判定为
阳性。

免疫染色实验方法和步骤免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。

1. 样品准备(Sample preparation)对于贴壁细胞：可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。

也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。

这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。

对于悬浮细胞：把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。

然后就可以进行后续操作。

如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。

对于冷冻切片：切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。

对于石蜡切片：脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。

无水乙醇5分钟，两次。

90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。

蒸馏水5分钟，两次。

抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。

2. 固定可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。

固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。

3. 封闭(Blocking)加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。

如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

免疫组织化学染色方法
免疫组织化学染色方法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。

该方法利用抗体与特定蛋白质结合的特异性，通过特定的染色反应可将该蛋白质定位于细胞或组织的特定位置。

免疫组织化学染色方法有多种类型，其中最常用的是免疫荧光染色和免疫酶标记染色。

免疫荧光染色利用荧光标记的二抗或直接标记的一抗来检测目标蛋白质，观察结果需要使用荧光显微镜。

免疫酶标记染色利用酶标记的二抗或直接标记的一抗来检测目标蛋白质，观察结果需要使用光学显微镜。

免疫组织化学染色方法在病理学、生物学、医学等领域中得到广泛应用，可以用于诊断疾病、研究生物学机制等方面。

该方法具有高特异性、高灵敏度、高分辨率等优点，但也存在某些局限性，如可能出现假阳性或假阴性结果、技术要求较高等。

- 1 -。