石蜡切片免疫荧光染色方法

石蜡切片免疫组化染色步骤石蜡切片免疫组化染色是一种常用的实验技术，用于研究组织、细胞和分子的结构与功能。

它通过使用抗体与特定抗原相互结合，然后使用酶、免疫荧光等标记物来检测这种结合，从而实现可视化染色和定位目标分子的目的。

下面，我们将详细介绍石蜡切片免疫组化染色的步骤。

步骤一：蜡块去蜡石蜡切片通常是由固定的组织样本制备而成，这些样本在处理过程中会被包埋在石蜡中。

因此，第一步是将蜡块去蜡。

首先，将蜡块放在温水中加热，使蜡块软化。

然后，将蜡块用刮刀从玻片上刮下。

这样可以得到蜡块去蜡后的组织样本。

步骤二：样本再固定在蜡块去蜡后，为了更好地保持组织的完整性和稳定性，通常需要对样本进行再固定。

常用的再固定方法是将样本放入4%的中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定4-24小时。

固定后，将样本从福尔马林中取出，用PBS（磷酸缓冲盐溶液）洗涤数次，以去除残余的福尔马林。

步骤三：切片制备在样本再固定后，需要将样本制备成切片。

首先，将组织样本放入甲醇中脱水，然后转移到乙醚中脱脂。

脱脂后，将样本放入苯骚酸乙酯中浸泡，使样本渗透均匀。

在苯骚酸乙酯中浸泡一段时间后，将样本转移到石蜡中浸泡。

石蜡具有很好的切片性能，可以更好地保持组织的结构。

最后，将样本放入石蜡包埋机中，进行加热和固化，制备成为石蜡块。

之后，使用旋转切片机将石蜡块切成4-6微米厚的切片。

切片后，将切片浸泡在热水中，使其展开并粘附在玻片上。

步骤四：抗原修复切片制备完毕后，需要对切片进行抗原修复。

抗原修复是为了使样本中的抗原能够更好地暴露出来，增加抗体的结合效率。

常用的抗原修复方法有热处理和化学处理两种。

热处理通常是将切片浸泡在含有缓冲盐的蒸馏水中，然后加热至高温（如95摄氏度）保持一定时间。

化学处理通常是将切片浸泡在含有抗原修复试剂的溶液中，如EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液。

抗原修复的时间和条件需根据具体实验的要求来确定。

步骤五：非特异性结合阻断为了减少非特异性结合，需要对切片进行非特异性结合阻断。

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织得采集、固定与保存:采取组织后,方法一:4％多聚甲醛(4％ＰＦＡ)4︒Ｃ固定1小时(根据组织大小与致密程度调整固定时间)或过夜方法二:采用boｕｉn’s固定ＲT 2h(6—8dｔeｓis)or RＴ过夜(成年tesiｓ)PBS缓冲液洗三次,每次5ｍin,4︒C保存于7０%乙醇中。

２、组织得包埋、切片、展片及保存::固定后得样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,５2－54︒C石蜡包埋,常规切片,切片厚4—１０μm,贴于处理过得干净载玻片上,37︒C烤片过夜,之后收集于载片盒中,RT密封保存。

石蜡包埋:保存于４︒Ｃ70％乙醇中得组织样品↓80％乙醇1５ｍin↓95%乙醇15 miｎ↓1０0%乙醇15mｉｎ⨯ 2↓1/2乙醇１／２二甲苯15 ｍin↓二甲苯透明5-１0 min↓1／２二甲苯１/2石蜡３0 min↓石蜡(1) 1。

5hｒ↓石蜡(2) 1.5－２.5hr↓石蜡(3) 包埋↓RT保存3、石蜡组织切片得免疫组化方法:密封保存于RT得组织切片↓二甲苯(1) 20 min↓二甲苯(2)20ｍin↓100％乙醇20ｍin↓95％乙醇10 min↓8０％乙醇10miｎ↓通风橱晾干,阻水笔在组织周围画圈↓切片在ＰBS中浸泡 5 ｍin＊2↓0.4%Tritonx RＴ10 mｉn↓切片在PＢS中浸泡 5 min＊3３％H２O2 RT １０ｍin切片在PBS中浸泡５ｍｉn*30、25％胰酶RT １0min切片在PBS中浸泡 5 min*３Blocking bｕｆfｅr(3%BSA+5%NGS＋０、2%Ｔritｏnx—１０0 in PBS) ＲT 60mｉn倾去blｏｃking buffｅｒ,勿洗一抗4 C overnighｔｉn blｏckinｇbuffeｒ取出切片复温1h,切片在PBＳ中浸泡 5 mｉn*３二抗iｎblocking ｂufｆer GＡR1:２00 (GＡM1:100),R Ｔ 1h切片在PBS中浸泡５min*3DAB显色５—１0min(５0微升A＋５0微升B＋９0０微升ＰBS+5微升3％H2Ｏ2)如果就是增强型DＡB只要1ｍｉn即可。

石蜡切片免疫荧光染色方法HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】对于石蜡切片：1、烤片：60℃ 60分钟2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。

3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。

修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。

2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H2O22(2ml H2O22加入18ml蒸馏水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。

（也可不用去除内源性酶）。

3. 封闭(Blocking)加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。

如果背景较高，可以4℃封闭过夜。

不用洗，用滤纸吸干周边水分。

从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。

4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。

立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。

PBS洗3次，每次5分钟。

5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

PBS洗涤3次。

每次5分钟。

如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

6. 蛋白检测(Detection of proteins)7. 复染用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。

石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。

1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。

其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。

2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。

石蜡切片(paraffin sections)免疫组化染色步骤1、载玻片的处理：抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。

这里选用ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。

具体方法如下：（1）APES：现用现配。

将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES 中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。

用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。

（2）HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogr ip液中，停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC 烤箱烘烤一小时，装盒备用。

（3）Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。

装盒备用。

试验中使用的器具均为非玻璃制品。

2、常用酶消化：（1）胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~4 0分钟，主要用于细胞内抗原的显示。

（2）胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。

（3）皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。

3、抗原热修复：可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。

抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。

枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其 pH值在6.0±0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。

免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次；3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 ；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；8．避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M 终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10；11．中性树胶封片。

免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。

(7)荧光显微镜观察拍照。

细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。

2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。

手动轻轻晃动数次，吸尽液体。

3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。

免疫荧光单标染色技术是一种用于检测特定抗原或蛋白质的方法，能够在细胞或组织中定位这些分子。

这种技术常常用于生物医学研究、临床诊断和药物开发中。

在进行免疫荧光染色之前，需要进行石蜡切片脱蜡至水的步骤，以确保样品的质量和稳定性。

第一步：脱蜡1.1 在进行免疫荧光染色前，首先需要将样品中的蜡质去除。

通常使用挥发性有机溶剂（如二甲基苯）来溶解蜡质，以达到脱蜡的目的。

1.2 脱蜡过程需要严格控制时间和温度，以避免对样品中的细胞结构和蛋白质的影响。

1.3 脱蜡后，样品需要经过多次洗涤，以保证蜡质完全被去除。

第二步：水洗2.1 脱蜡后的样品需要经过一系列的水洗步骤，以移除残留的有机溶剂，并保证细胞或组织的完整性。

2.2 水洗过程需要使用高纯度的蒸馏水，并频繁更换，以避免污染和离子残留。

2.3 水洗后，样品需要进行去离子处理，以避免水中离子对免疫荧光染色的干扰。

免疫荧光单标染色技术通过上述步骤，可以在细胞或组织中准确地检测和定位特定抗原或蛋白质。

在这个过程中，严格控制的脱蜡和水洗步骤对于提高染色的敏感性和稳定性非常重要。

个人观点和理解：免疫荧光单标染色技术是一种非常重要的生物医学研究工具，它可以帮助科研人员和临床医生更好地理解细胞和组织中的蛋白质定位和表达水平。

而其中的石蜡切片脱蜡至水的步骤，是确保染色质量的关键一环。

只有通过严格的处理和洗涤，才能保证样品的稳定性和免疫荧光染色的准确性。

总结回顾：通过本文的阐述，我们深入探讨了免疫荧光单标染色技术中石蜡切片脱蜡至水的关键步骤。

这些步骤不仅仅是简单的预处理，更是整个染色过程中样品质量的保证。

在未来的研究和实践中，我们应该更加重视这些细节步骤的执行，以确保最终的实验结果的准确性和可靠性。

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石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。

然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。

固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。

2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。

首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。

接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。

最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。

3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。

使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。

切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。

4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。

不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。

修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。

5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。

将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。

然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。

接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。

6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。

使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。

注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。

2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。

3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。

4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。

5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。

免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。

二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。

（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。

（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。

（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。

Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。

当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。

（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。

注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。

所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。

微波法最为常用。

（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。

（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。

（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。

（10）次日取出切片，室温下复温30min。

（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。

（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。

（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。

利用ABC kit （Vector ）进行石蜡切片免疫染色Part 1： —抗孵育（一） :脱蜡亲水Xylene1 — 4中浸泡5min ，共四次100 % EtOH 中浸泡10min ，共2次95 % EtOH 中浸泡 5min90 % EtOH 中浸泡 5min80 % EtOH 中浸泡 5min70 % EtOH 中浸泡 5min蒸馏水洗涤3次，每次5min（二） 封闭非特异性过氧化反应新鲜0.3% H 2O 2 in 甲醇，室温孵育 10min蒸馏水洗涤2次，每次5minNote :时间不可太长，否则也会阻断特异反应（三） 抗原修复抗原修复液盛在染色缸中，在微波炉中加热至沸腾（约8min ）,为防止沸腾液体喷出，可在缸中放入切片架子一起加热。

切片浸入已沸的抗原修复液，重新放回微波炉加热至沸腾后，继续加热5mi n 取出染色缸，自然冷却至水温恢复到室温。

蒸馏水洗涤3次，每次5minNote : 1:加热的过程中要盖盖子，以免水分蒸发，抗原修复液的浓度发生改变2 : 10X 抗原修复液的配制：柠檬酸钠 柠檬酸 PBS 用时视用量稀释成1X 液，1X 液的PH 值恰为需要的6.0（四）一抗孵育将湿盒中放入适量的蒸馏水 （避免切片放入后干掉）将切片表面的水稍稍甩去，用阻水笔沿标本边缘圈起，要稍稍大于标本的边缘，防止标本边缘干掉切片放在湿盒中，将稀释好的一抗覆盖在标本表面，用枪头轻柔地吹打混匀，避免气泡 将湿盒放入4度冰箱过夜，或是 37度1 — 2hNote :切片必需保持湿润，不能干掉，否则干掉的样品会呈现非特异显色；但是切片上也不能残留过多水 分，会降低抗体浓度，所以，动作要快Part 2 :二抗孵育，显色（一）二抗孵育回收或不回收切片上的一抗切片在蒸馏水中洗涤 3次，每次5min15g2g500ml 切片冷冻保存的二抗37度迅速融化，按照1: 10的比例加入5% Skim Milk （脱脂奶粉）甩去切片上残留的水分，立即将二抗覆盖在标本表面，用枪头轻柔地吹打混匀，避免气泡37度，孵育1hNote: 1:二抗中的5% Skim Milk要在用之前现用现加，脱脂奶粉是为了阻断非特异性反应，现用现加是为了避免阻断二抗的识别反应2：5%的脱脂奶粉（5g奶粉in 100ml PBS ）最好新鲜的，配好后在4度保存，超过1周不要再用。

石蜡切片免疫荧光技巧
石蜡切片免疫荧光技术是一种常用的免疫组织化学方法，用于检测或定位特定抗原在组织样本中的分布情况。

以下是石蜡切片免疫荧光技术的步骤：
1. 组织固定和包埋：将组织样本固定在含有4%的缓冲甲醛中，以保持其形态和结构。

之后，将组织样本包埋在去离子石蜡中，以增加其硬度和切片的稳定性。

2. 去除蜡并切片：用刀片将固定和包埋的组织样本切割成薄片，通常为4-10微米厚。

3. 抗原解蜡：将蜡切片浸泡在去蜡溶液中，以去除蜡，并将其进行再水化，以恢复组织的水合状态。

4. 抗原检测：用适当的抗体与特定的抗原结合。

首先，用一种可以结合到抗原的初级抗体处理组织切片。

然后，使用荧光标记的二级抗体结合到初级抗体上，从而使标记可见。

5. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察组织切片，并通过选择合适的滤光片来检测和分析特定抗原的荧光信号。

不同的荧光染料可用于标记不同的抗原，以实现多重标记和多抗体检测。

石蜡切片免疫荧光技术具有高度的灵敏性和特异性，可用于检测和研究生物标志物在各种疾病和组织中的分布和表达水平。

石蜡切片免疫荧光实验步骤1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。

2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。

此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min（具体修复液和修复条件根据组织来确定）。

3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体流失。

4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗同源血清封闭）。

5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。

6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。

7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。

8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。

9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。

10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。

石蜡切片免疫荧光实验步骤石蜡切片免疫荧光实验步骤1、脱蜡至水：将组织切片室温放置10min后，依次将石蜡切片放入二甲苯3min→无水乙醇5min—85%酒精5min—75%酒精5min—ddH2O洗5min。

2、抗原修复：组织切片置于盛满柠檬酸抗原修复液（50X稀释至1X使用)的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（中火8min—停火8min—中低火7min）。

此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。

自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min （具体修复液和修复条件根据组织来确定）。

3、画阻水圈：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，防止液体流失。

4、BSA封闭：在圈内滴加3%-5%浓度BSA孵育30min（或二抗同源血清封闭）。

5、一抗孵育：轻轻甩干封闭液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗（溶于血清：PBS=1:19的抗体稀释液体系中），切片平放于湿盒（内加少量水防止抗体蒸发），4°C过夜。

6、二抗孵育：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加相应的荧光二抗，覆盖组织，避光RT孵育50min。

7、DAPI染核：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光RT孵育3-5min。

8、树脂封片：玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

切片稍甩干后用树脂封片剂封片（其间可滴加少量抗荧光淬灭剂）。

9、镜检拍照：切片于荧光显微镜/confocal/活细胞工作站中观察并采集图像（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发橙光；CY5发红光）。

10、结果判读：DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，阳性表达为相应荧光素标记的红光或者绿光，图片处理需使用Image J 软件。

石蜡切片免疫荧光操作规程试剂1)二甲苯2)PBS缓冲液3)0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

4)goat血清5)一抗稀释液：3%BSA in TBS，pH7.4操作流程1.脱蜡和水化脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；2）无水乙醇中浸泡5min；3）95%乙醇中浸泡5min；4）70%乙醇中浸泡5min；2.PBS洗两次各5min。

3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

煮沸热修复电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15min，必须等缓冲液冷却后，方能将切片取出。

4.PBS洗5min。

5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。

6.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。

7.PBS洗3次每次5min。

8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。

（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。

）9.PBS洗3次每次5min。

10. Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，50ul/片，染色10min。

11. PBS洗3次每次2 min。

12.封片：Mounting Medium封片，等Mounting Medium凝固后再拍照。

石蜡切片免疫荧光实验步骤
一、样品处理
1、选择适当体积的样品石蜡切片，防止干燥，封好盖子到-80℃，直
到使用时将其取出变性到室温，以备后续操作。

2、室温下取出石蜡切片，施加蛋白酶将切片上原有的细胞、细胞膜
分解，具体操作步骤为：将取出的石蜡切片放入0.1%胰蛋白酶(Protease，Roche)或0.5% Triton X-100溶液中，置于37℃水浴摇床，25min后将石
蜡切片放入3mm×2mm的转移槽内，加入200ul去离子水，搅拌进行超声
处理，30s后用1000ul去离子水冲洗，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。

二、组织切片染色
1、在刻线玻片上放入石蜡切片，用吸水棉柱将石蜡切片固定。

2、用0.1%胰蛋白酶(Protease, Roche)或0.3% Triton X-100溶液
浸泡石蜡切片，置于37℃水浴摇床，15min后去除液体，另用500μl去
离子水洗涤，将含有抗体的抗体溶液稀释至0.3μg/ml，加入石蜡切片上，放入35℃恒温箱，反应1h。

3、取出石蜡切片，加入1000μl去离子水洗涤，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。

三、免疫荧光检测
1、把石蜡切片放入适量的去离子水中浸泡，去除多余的抗体。

2、将放入去离子水中浸泡的石蜡切片放入多孔玻片，在摇床上稀释FITC标记的抗体，加入石蜡切片上，置于37℃水浴摇床上，1h后去除液体。

1.石蜡片二甲苯、酒精梯度脱蜡复水；2.透化。

0.25%TritonX-100处理细胞10-30分钟；3.抗原修复。

微波热修复（柠檬酸盐修复液或EDTA抗原修复液）6分钟两次，中间间隔5分钟。

冷却至室温。

4.滴加与二抗同源的正常血清封闭（如10%山羊血清），室温20分钟。

甩去多余液体，不洗。

5.滴加适当稀释的一抗，37C1～2小时或4℃过夜。

0.01MPBS洗2分钟×3次。

6.滴加一抗相对应的荧光素标记二抗，37℃避光孵育30-60分钟。

0.01MPBS洗2分钟×3次。

7.DAPI染细胞核2-5分钟，清洗。

8.抗荧光衰减封片剂封片。

荧光显微镜观察。

1.冰冻片从冰箱取出后PBS浸泡恢复至室温；2.透化。

0.25%TritonX-100处理细胞10-30分钟；3.抗原修复。

预实验可以尝试不修复，若结果不理想可尝试蛋白酶消化10分钟（为主），或微波热修复（柠檬酸盐修复液或EDTA抗原修复液）6分钟两次，中间间隔5分钟。

冷却至室温。

4.滴加与二抗同源的正常血清封闭（如10%山羊血清），室温20分钟。

甩去多余液体，不洗。

5.滴加适当稀释的一抗，37℃1~2小时或4C过夜。

0.01MPBS洗2分钟×3次。

6.滴加一抗相对应的荧光素标记二抗，37℃避光孵育30-60分钟。

0.01MPBS洗2分钟×3次。

7.DAPI染细胞核2-5分钟，清洗。

8.抗荧光衰减封片剂封片。

荧光显微镜观察。

石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。

2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。

石蜡包埋：保存于4C 70%乙醇中的组织样品80%乙醇15 min95%乙醇15 min100%乙醇15min 21/2乙醇1/2二甲苯15 min二甲苯透明5-10 min1/2二甲苯1/2石蜡30 min石蜡（1） 1.5hr石蜡（2） 1.5-2.5hr石蜡（3）包埋RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1) 20 min二甲苯(2) 20 min100%乙醇20min95%乙醇10 min80%乙醇10 min通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡 5 min*20.4%Tritonx RT 10 min切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。

免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。

免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。

(7)荧光显微镜观察拍照。

细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。