植物显微技术一、名词解释石蜡制片法：用石蜡做包埋剂，将植物组织固定、脱水、透明、浸蜡包埋在石蜡中，然后用切片机切片徒手切片法：用锋利的剃刀或双面刀片，把新鲜的或已固定的植物材料（根茎叶等）切成薄片，用临时装片法（染色或不染色）装片，在显微镜下观察植物内部结构的方法冰冻切片法：将植物材料（新鲜样品立即在液态氮或其他制冷剂中冰冻或经化学固定后再冰冻）置于低温下冰冻至一定硬度后直接进行切片的方法滑走切片法：用滑走切片机对植物材料进行切片的方法。
既可以切新鲜或固定的材料，也可以切石蜡包埋后的材料压片制片法：将植物材料酸解或酶解后置于载玻片上，再在载玻片上盖上盖玻片并施加外力，使得正在有丝分裂的材料的染色体得以铺展的进行制片的方法涂片制片法：将植物材料酶解去掉细胞壁后，经低渗液处理，用酒精灯火焰干燥使得染色体膨胀，用镊子捣碎后将材料铺展开，得到分散良好的铺展的染色体与细胞核标本整体制片法：将微小的植物材料或部分组织器官经整体制成永存玻片的方法离析法：在研究植物细胞时，为了详细研究单个细胞完整的形态结构，用一些化学药品（酸碱酶）将细胞与细胞之间的胞间层溶解，使细胞彼此分离成单个细胞的方法固定：用化学或物理的方法，迅速杀死植物细胞或组织，使细胞或组织的形态结构尽量保持在其生活时的状态脱水：用脱水剂逐步取代样品中水分的过程透明：是脱水与浸蜡，脱水与封藏之间的桥梁。
材料经各级乙醇脱水后，组织内部已没有水分，但脱水剂（乙醇）与石蜡不相溶，石蜡不能进入到组织或细胞中，必须经过一种既能和脱水剂混合又能溶解包埋剂（如石蜡）的溶剂（如氯仿）来处理，使包埋剂浸入植物组织或封藏。
由于这种溶剂可使材料透明，所以这一过程称为透明染色：使植物组织染上颜色便于观察浸蜡：将包埋剂石蜡逐步透入植物组织和细胞取代透明剂的过程包埋：将溶解的石蜡倒入包埋盒，再将经石蜡浸透的组织放入盒中，调整材料位置并使之迅速冷却，石蜡由液态凝固成蜡块的过程封藏：将封藏剂均匀地、适量地布满在材料上，轻轻盖上干净的盖玻片，便于后续的观察和研究，经封藏后切片可以长期保存显微摄影：是显微成像技术和显微成像艺术的有机结合，可获得清晰真实的生物图像，用于阐明动植物形态发生发育规律景深：在焦点所及范围内主题最近部分到最远部分的距离分辨率：物镜所能分辨两个点的最短距离二、填空：1、植物制片方法按照保存时间可分为两种类型：临时制片法和永存片制片法。
2、植物制片方法，其中切片法可以分为7种类型：石蜡切片法、徒手切片法、冰冻切片法、滑走切片法、半薄切片法、超薄切片法、振动切片法3、FPA是最常用的植物样品固定液，分别是由：福尔马林，丙酸，70%乙醇。
4、FAA是最常用的植物样品固定液，分别是由：福尔马林，乙酸，50%或70%乙醇5、透明剂都是石蜡溶剂，不能与水混合。
常用的透明试剂有：二甲苯，氯仿，冬青油6、植物组织的染色，木质化细胞常用番红O染成鲜艳的红色，用固绿把纤维素细胞壁和细胞质染成鲜艳绿色7、封藏是植物制片的最后一步，常用的封藏剂有：加拿大树胶、中性树胶、达马树胶、油派胶8、显微镜按属性分：光学显微镜、非光学显微镜；按用途分：生物显微镜、体视显微镜、偏光显微镜、电子显微镜、特种显微镜9、摄影技术中控制景深的三要素：光圈、镜头焦距、拍摄距离10、照相机的图像传感器主要有两种类型：CCD和CMOS11、数码照相机的常用存储卡类型：SD卡、CF卡、记忆棒12、照相机的快门有两种类型：镜间快门、焦平面快门13、石蜡切片常用粘贴剂主要有两种类型：蛋清甘油、明胶甘油14、照相机的镜头一般可以分为：鱼眼镜头、广角镜头、标准镜头、长焦距镜头、变焦镜头、微距镜头15、闪光指数GN是衡量闪光灯闪光强度的指标，也是闪光摄影曝光的依据：GN=光圈数*被摄体的距离（感光度100时）16、石蜡制片法中最常用的脱水剂是乙醇，脱水的方法应该逐级进行，由低到高的梯度，不能将材料直接置于高浓度脱水剂中，否则会使细胞收缩或损坏17、显微镜由光学部分（包括照明）、机械部分、摄影部分等三部分组成，各部分在显微镜中相互配合发挥出其独特功能18、显微镜经历了大致三个阶段，并沿着这三个方向发展着，肉眼观察的解剖水平、光学显微镜观察的显微结构水平、电子显微镜观察的超微结构水平，这三个阶段是密切联系、相互促进的，其发展有越来越快、功能越来越完善的趋势三、问答1、石蜡制片步骤：取样：材料的选择与分割→固定、保存→冲洗、染色（整染）→脱水（各级乙醇，低浓度到高浓度）→透明（透明剂，低浓度到高浓度）→浸蜡（低浓度到高浓度）→包埋（石蜡包埋剂）→切片（旋转切片机）→展片、粘片→烘片→脱蜡（脱包埋剂石蜡）→复水（各级乙醇，高浓度到低浓度）→染色（片染）→分色→脱水（各级乙醇，低浓度到高浓度）→透明→镜鉴、封藏→烘片、观察、摄影（烘片后可长期保存一永存片）。
2、试比较石蜡制片法和徒手制片法的主要特点：石蜡切片法以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将样品切成薄片（一般为8~12μm，可以连接成蜡带），经一系列处理后制成永存片。
切片厚度由切片机控制，比较均匀。
徒手切片用锋利的剃刀或双面刀片。
方法简便、快速，设备要求简单。
但徒手切片技术要求熟练，才能切出符合要求的薄片。
切片厚度为20~25μm3、石蜡制片法在取样时应注意哪些方面：○1选择新鲜、健壮、正常、有代表性的材料（病理解剖材料除外）；○2取材时注意按植物的生长季节及生长发育的不同阶段选取（可安排定期取样）；○3取材大小要适当，一般在5~10μm为宜，便于制片；○4取材时选取所需部位，切去多余的部分，最好能先做徒手切片观察，决定是否适用；○5切去材料时必须使用锋利的新刀片，要尽量避免损伤植物体或选取的部位，并立即固定，防止变化；○6注意切面：在切取器官时，应根据制片的要求，选取最能代表其结构的切面。
常用的切面包括横切、纵切、径向切等；○7尽量保持植物组织原有的形态。
4、叙述扫描电子显微镜的特点：○1能够直接和多角度观察样品表面的结构。
○2样品制备过程简单，不用切成薄片。
○3景深大，图像富有立体感。
○4图像的放大范围广，分辨率较高。
分辨率介于光学显微镜与透射电镜之间，最高可达3nm。
○5在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号做微区成分分析。
5、叙述扫描电子显微镜常规制样方法：○1取材：取样要准确，体积不宜过大，以减少不必要的观察量。
取样时动作要轻巧，防止因挤压而损伤样品；○2固定：一般采用双固定法，即先用1%~3%的戊二醛/缓冲液在室温或4℃下前固定。
一般单细胞可固定10~30min，较大样品固定可达1~2h，甚至更长。
再用1%锇酸/缓冲液在4℃下固定30~60min；○3清晰：对于表面凹凸不平，且粘有许多杂质的样品，在固定的前后都要进行彻底的清洗，以免影响成像的质量。
一般采用缓冲液清洗法：缓冲液在4℃下彻底清洗3次，每次15min；○4脱水和置换：用系列乙醇或丙酮逐级脱水。
一般从30%→50%→70%→80%→95%→100%，每步15~20min。
用乙酸异戊酯置换100%的乙醇，在室温下，置换20min以上。
因为乙酸异戊酯与液体二氧化碳能更好地混溶，置换便于下一步用液态CO2进行临界点干燥；○5干燥：样品制备过程中关键一步，直接关系成像的质量。
干燥的方法有若干种，如临界点干燥、空气干燥、化学药品干燥和冷冻干燥等。
临界点干燥法是一种较好的干燥方法；○6粘样：将干燥好的样品用导电胶或双面透明胶纸粘在样品台上，做好标记；○7喷涂：喷涂要在真空条件下进行，有专门的仪器，一般喷涂10~20nm厚的金或铝，使样品有良好的导电性，能顺利释放二次电子。
目前常用离子溅射法和真空喷镀法。
喷好的样品就可以用扫描电镜观察。
如果一时不能观察，需把样品放入干燥器中保存，以防止受潮和被污染。
6、叙述摄影过程中控制景深的主要办法：1）改变镜头的孔径，孔径越小，景深越大，孔径越大，景深越小2）改变镜头的焦距，焦距越短，景深越大，焦距越长，景深越小3）控制镜头距离被摄物的远近，被摄物越远，景深越大，被摄物越近，景深越小。
7、叙述数码显微摄影的操作过程及后续图像处理方法：以体视显微镜观察附地菜叶片背面为例1、材料照片：打开电源开关，调整光强大小至合适程度，将所需观察的材料放在培养皿中，置于工作台上。
2、调焦：综合运用粗调微调焦轮调焦，在使用粗调焦轮时应格外注意工作距离的变化，以防镜头过度下降碰到材料，损伤镜头。
3、观察：调焦合适后在目镜下观察材料，观察时尽量选择最佳光圈，注意调整变倍螺旋以改变变倍比，选择合适的放大倍率。
4、拍摄：打开与之相连电脑上的相机拍摄软件，调整光程转换拉杆，使照相机光路连通。
进入拍摄界面，此时电脑屏幕中所显示的图像，即为显微镜中所对应的图像，对所选图像进行对焦，至图像清晰，鼠标点击“捕捉”，将所需图像捕捉住，进行拍摄，然后调整标尺比例至与显微镜放大倍率相对应的大小，打开“图视”中的“叠加比例尺”，将标尺放在图像上，将图片以TIFF格式保存，选择适宜的位置，然后点击保存，将图片命名为植物名、所拍部位、放大倍率、日期等。
5、图像处理：在进行图像处理前，先对原始图像进行拷贝，以防原始图像丢失。
使用Photoshop软件，稍稍调整所拍图像的曝光度、对比度、亮度，然后将图像保存为JPEG格式的图像。
8、叙述植物组织化学的概念和应用特点植物组织化学是应用化学反应或化学反应与染色相结合的方法，将植物组织或细胞中的某种化学成分在组织切面内原位显示（如细胞内的核酸、蛋白质、脂肪等），用于研究和测定植物器官、组织及细胞中的化学组成、内含物种类、化学性质、含量和分布。
植物组织化学染色的特点是利用已知的化学反应原理，选用特定的试剂使植物体内特定的化学成分呈现出特定的颜色。
植物组织化学可以与染色法相结合，使植物组织呈现出不同的颜色9、叙述原位杂交的概念和原理原位杂交是指在组织或细胞内进行分子杂交的技术，是分子生物学与组织化学相结合的技术原理：利用核酸分子碱基互补配对原则，首先制备染色体或细胞核制片或植物组织制片，将制片与经标记的探针变性成单链，二者复性，成为杂合双链核酸，再通过一定的检测手段将外源核酸在染色体或细胞核或组织细胞上的位置快速、直观、准确地表达出来10、切片在染色中应注意哪些事项1）应根据观察的目的，材料的结构、性质，选择适当的染色方法2）当材料从一种溶液进入染色剂时，两种溶液的浓度必须相同3）酸性染色剂比碱性染色剂着色速度快，双重染色时应先碱性染色剂染色再酸性染色剂4）染色宁可颜色深一些，因为在水洗和脱水过程中会褪色，尤其是使用分色剂时更应该染深些5）使用分色剂时，应在低倍显微镜下随时观察，分色适宜即彻底冲洗，否则会影响下一步的染色6）染色的时间应根据材料的厚度、、结构性质，染色的成分配方等灵活调节补充植物制片的目的：因为植物体较大且不透明，不能直接在显微镜下观察。
