YPD培养基配制

1. LB培养基：10 g/L胰蛋白胨(进口)，5 g/L酵母提取物(进口)，10 g/L NaCl。

若配制固体培养基，加入15 g琼脂粉；
2. YPD培养基：22 g/L的一水合葡萄糖，20 g/L胰蛋白胨(进口)，10 g/L酵母提取物(进口)。

若配制固体培养基，加入20 g琼脂粉；
3. SC-Ura培养基：22 g/L含一水合葡萄糖，6.7 g/L YNB（无氨基酸酵母氮源），1.224g/L 氨基酸粉末（除Leu , Trp , His , Ura, Ade, Lys, Met以外的），配制相应缺陷型则补加其他7种氨基酸。

4. YPX 培养基：蛋白胨，20 g/L；酵母粉，10 g/L；木糖，20 g/L或50 g/L。

5. YPD+G418：G418：1ml/L
Leu（亮氨酸）0.38 g/L，
Ura（尿嘧啶）0.076 g/L，
100xHis（组氨酸）7.6g/L，加入10mL/L
100xTrp（色氨酸）7.6g/L, 加入10mL/L
100xAde（鸟嘌呤）7.6g/L 加入10mL/L
100xLys（赖氨酸）7.6g/L 加入10mL/L
100xMet（甲硫氨酸、蛋氨酸）7.6g/L 加入10mL/L
加入碱液调节pH至6.10左右。

若配制固体培养基，加入20 g琼脂粉；
全部氨基酸：。

毕赤酵母感受态细胞制作1、GS115活化：100ml三角瓶中装入20ml YPD培养基，接种100ul菌保，过夜活化。

2、转接：500ml三角瓶中装入100ml YPD培养基，取1ml活化菌液接种到100ml YPD培养基中，培养至OD约为1.3-1.5。

3、收菌：将菌放置冰上15min，或者放于4°冰箱冷却。

一般100ml菌液可以制备4份感受态细胞。

将无菌水和过滤除菌的山梨醇（1M）提前置于4°冰箱冷却。

4、用100ml离心管收集菌体，4000rpm/min离心5min去除YPD培养基。

5、用20ml预冷的无菌水洗菌体，4000rpm/min离心5min，重复一次。

6、用20ml预冷的山梨醇洗菌体，4000rpm/min离心5min。

7、每个离心管中加入3ml预冷的山梨醇，重悬菌体。

7、将菌体分装至1.5ml灭菌离心管中，分装4管，4000rpm/min离心5min，弃上清。

8、每管加入80ul预冷山梨醇，重悬菌体，置于冰上待用或加入10%DMSO保存于-80冰箱。

毕赤酵母电击法转化1、将感受态细胞在冰上融化，电转杯和山梨醇在冰上预冷。

2、将80ul感受态细胞与5-10ug线性化质粒混合，转移至0.2cm电转杯中，置于冰上5min。

3、根据电转仪选择合适的程序，进行电击。

4、电击后立即加入500ul预冷的山梨醇，将电击杯中液体全部转移至无菌的1.5ml离心管中，30℃水浴2h。

5、将菌体低转速离心5min，吸出多余上清，留100ul涂板即可。

6、将菌液均匀涂布于His缺陷型培养基，30℃培养1-2天。

要准备灭菌的有：水，1M山梨醇，滤器，大离心管，1.5ml离心管，大小枪头，所有的离心都是低温离心。

YPD培养基YPD 或YPED，：Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)，又叫酵母浸出粉胨配方：1% Yeast Extract（酵母膏），2% Peptone（蛋白胨），2% Dextrose (glucose)（葡萄糖），若制固体培养基，加入2%琼脂粉配制方法：1 .溶解10gYeast Extract（酵母膏）, 20gPeptone（蛋白胨）,20g琼脂粉于900ml水中2 .高压 115度 20min3.加入100ml 10×Dextrose (glucose)（葡萄糖），(葡糖糖溶液灭菌后加入) ,注：葡萄糖，yeast extract ,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。

酵母的分离与纯化1、接种：取酵母0.5克，加入到5ml的YPD培养液中，在30℃摇床中过夜培养，可见培养液变浑浊。

2、计数：将酵母菌液稀释到合适的倍数（约102-103倍）以每小格的菌数可数为度，涂于血球计数板上，在高倍显微镜下计数酵母菌数。

3、涂皿：将培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml稀释合适倍数的菌液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。

做平行样。

4、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上三区划线，培养后分离得到单个菌落。

5、镜检：挑取单菌落，制片观察其形态。

6、菌种保藏：接种酵母菌到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，长出菌苔后冰箱保藏。

血球计数板使用1.取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

将菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液，然后加盖盖玻片（勿使产生气泡）。

2.静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。

将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。

培养基的配方：YPD完全培养基：酵母提取物10g/L ，蛋白胨20g/L ，葡萄糖20g/L，（固体培养基1.5%琼脂）；MM：13.4 g/L YNB，4x10-4 g/L 生物素，5 ml/L 甲醇，15 g/L 琼脂MD：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖操作方法：用无菌牙签挑取his+转化子的单克隆并分别按先后顺序划到MM和MD平板上（不同的克隆需换牙签），30℃培养两天，观察平板。

在MM和MD平板上均能正常生长的菌落表型为Mut+（Methanol utilization plus），在MD 平板上能正常生长但在MM 平板上生长相对缓慢或者不生长的菌落表型为Muts (Methanol utilization slow)。

用点MM、MD平板点方法。

准备几块MM、MD，平板用maker笔划小格子，标号，两种平板点标号要一一对应。

准备无菌牙签，点取G418板上长出点菌落，先轻轻点MM平板（小格内），再点到MD平板相同标号点小格内。

如此点约100个转化子，30℃培养2-5天，观察比较MM、MD上相同标号点菌落，MD平板上生长快，MM平板上生长缓慢或不生长点为Muts，生长速度一样点为Mut+。

原理是Mut+能够快速利用甲醇为碳源，而Muts则不能利用甲醇为碳源。

所以Mut+能够在含甲醇（MM)平板也快速生长，而Muts只能在含葡萄糖（MD)平板快速生长。

MD培养基是怎么筛选酵母的?细菌在这种培养基上是不是不生长?MD （Minimal Dextrose Medium，最小葡萄糖培养基）组成如下：（YNB 13.4g/l、葡萄糖20g/l、生物素4×10-4g/l、若制平板加琼脂粉15g/l），它属于组氨酸缺陷型培养基，细菌能生长，配制完后仍需高压蒸气灭菌处理。

用于表达的毕赤酵母都属于组氨酸缺陷型的，只有染色体上成功整合入重组质粒载体基因的毕赤酵母菌株才能在组氨酸缺失的MD培养基生长，以此筛选出重组子。

常用微生物培养基分离真菌：注：抗生素所有培养基灭菌放置不烫手背时（温度约为40°C左右），同时加入氯霉素和链霉至终浓度为0.5 mg/mL（提前配置好，用0.22 µm微孔滤膜过滤，-20℃存储），混匀后倒平板，用于抑制细菌生长。

1.GPY培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母提取物10 g，海盐15 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.5，115℃，30 min灭菌2.PDA培养基：Potato Dextrose Agar干粉39 g/L，海盐15 g，蒸馏水1 L，pH 6.5-7.0，121℃，15 min灭菌3.马丁培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾1 g，七水合硫酸镁0.5 g，孟加拉红0.03 g，海盐15 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，115℃、30 min灭菌4.MEA培养基：麦芽浸粉17g，蛋白胨3g，海盐15g，蒸馏水1L，121℃，20 min 灭菌5.YPD培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，115℃，30 min灭菌6.沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，每升培养基）：蛋白胨（peptone）10.0 g，葡萄糖（glucose）40.0 g，琼脂（agar）15.0 g，pH 4.0 - 6.0；7.酵母汁麦芽提取物琼脂培养基（YM，每升培养基）：麦芽浸粉（malt extract）3.0 g，酪蛋白胨（casein peptone）5.0 g，酵母提取物（yeast extract）3.0 g，葡萄糖（glucose）10.0 g，琼脂（agar）15 g，pH 6.0 - 6.5；8.察氏培养基（CDA，每升培养基）：硝酸钠（NaNO3）3. 0 g，氯化钾（KCl）0.5 g，蔗糖（sucrose）30. 0 g，七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）0. 01 g，磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0 g，琼脂（agar）15.0 g，pH 6.0 - 6.5；分离放线菌：注：抗生素所有培养基灭菌放置不烫手背时（温度约为40℃左右），同时加入制霉菌素（终浓度为100.0 μg/ml）和萘啶酮酸（终浓度为25.0 μg/ml）（提前配置好，用0.22µm 微孔滤膜过滤，于-20℃冻存），混匀后倒平板，分别用于抑制真菌和细菌生长。

主要培养基：10×YNB（13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：溶解13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。

500×B（0.02%生物素）：溶解20mg生物素于100mL 水中，过滤除菌，放于4℃。

100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃。

10×D（20%葡萄糖）：溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1年。

500×生物素(0.02%)：溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。

100×H（0.4%组氨酸）：溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50 度加热以促溶解，过滤除菌，可放1年。

10×M（5%甲醇）：混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。

10×GY（10%甘油）：混合100mL甘油与900mL 水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。

100×AA（0.5%各种氨基酸）：溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于100mL 水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。

1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.0：32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为6.0±0.1（如果需调pH值，用磷酸或KOH）。

过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。

100mg/mL遗传霉素：用无菌水制备30mL 100mg/mL 遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。

用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：0.25，0.5，0.75，1.0，1.5，1.75，2.0，3.0，4.0。

LB培养基：5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH7.0；高压灭菌后4℃保存。

细菌培养常用培养基和抗生素的配制方法、常用培养基1、LB 培养基将下列组分溶解在0.9L 水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g如果需要用INNaOH （〜1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。

注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。

2 、SOB 培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨20g酵母提取物5g氯化钠0.5g1mol/L 氯化钾2.5ml用水补足体积到1L。

分成100ml的小份，高压灭菌。

培养基冷却到室温后，再在每100ml 的小份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁。

3、SOC培养基成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁外，再加2ml 灭菌的1mol/L 葡萄糖（18g 葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。

4 、TB 培养基将下列组分溶解在0.9L水中:蛋白胨12g酵母提取物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。

冷却到60 C , 再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4/0.72mol/LK2HPO4 的溶液（2.31g 的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。

高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。

5、2X Y培养基将下列组分溶解在0.9L水中:蛋白胨16g酵母提取物10g氯化钠4ml如果需要用INNaOH (〜1ml )调整pH 至7.0，再补足水至1L 。

注：琼脂平板需添加琼脂粉 12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉 7g/L 。

6、YPD 培 养基将下列组分溶解在 0.9L 水中： 蛋白胨 20g 酵母提取物 10g 葡萄糖 20g用水补足体积为 1L 后，高压灭菌。

建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基 添加1.6g 色氨酸，因为 YPD 培养基是色氨酸限制型培养基。

细菌培养常用培养基和抗生素的配制方法一、常用培养基1、LB培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g如果需要用1NNaOH（～1ml)调整pH至7。

0,再补足水至1L。

注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L，上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L.2、SOB培养基将下列组分溶解在0。

9L水中：蛋白胨20g酵母提取物5g氯化钠0。

5g1mol/L氯化钾2.5ml用水补足体积到1L。

分成100ml的小份，高压灭菌。

培养基冷却到室温后，再在每100ml 的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。

3、SOC培养基成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后,除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足够水中,再用水补足到100ml,用0.22um的滤膜过滤除菌）。

4、TB培养基将下列组分溶解在0。

9L水中：蛋白胨12g酵母提取物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。

冷却到60℃,再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4/0。

72mol/LK2HPO4的溶液(2。

31g的KH2PO4和12。

54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml.高压灭菌或用0。

22um的滤膜过滤除菌）.5、2×YT培养基将下列组分溶解在0。

9L水中：蛋白胨16g酵母提取物10g氯化钠4ml如果需要用1NNaOH（~1ml）调整pH至7.0,再补足水至1L。

注:琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。

6、YPD培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨20g酵母提取物10g葡萄糖20g用水补足体积为1L后,高压灭菌.建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基添加1。

6g色氨酸,因为YPD培养基是色氨酸限制型培养基。

为了配制平板，需要在高压灭菌前加入20g琼脂粉。

二、常用抗生素氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。

LB培养基：是微生物学实验中最常用的培养基，用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。

用于培养大肠杆菌、枯草杆菌等细菌，分为液态培养基和加入琼脂制成的固态培养基。

加入抗生素的 LB 培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主的克隆。

PDA培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基，即Potato Dextrose Agar （Medium），依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。

宜培养酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。

改良MC培养基：用于乳酸菌饮料中乳酸菌的菌落计数；原理：大豆蛋白胨、牛肉膏粉和酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子；葡萄糖和乳糖为可发酵糖类提供碳源；乳酸菌发酵糖产酸使菌落周围碳酸钙溶解，以辨别乳酸菌；琼脂是培养基的凝固剂；中性红为pH指示剂。

MRS培养基：乳酸菌培养基，由多种成分组成，适用于乳酸菌的生长，用来分离培养乳酸菌的一类培养基，一种常用的培养基，宜培养分离乳酸菌。

由于该培养基十分适于乳酸菌的生长，而且抑制其他菌的生长，因此具有分离乳酸菌的功能。

当乳酸菌长成后在培养基上显黄色，之后会变淡黑色。

以此分离乳酸菌。

乳酸菌：凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。

这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。

除极少数外，其中绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，其广泛存在于人体的肠道中。

目前已被国内外生物学家所证实，肠内乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。

乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。

常见菌种有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌等基时加入）。

pH值用5mol/L NaOH溶液调至7.2-7.4（用精密pH试纸测定）。

配置完后在高压锅内高压灭菌21min。

二、YPD培养基配制（酵母菌培养基）1）溶解酵母膏/酵母粉（yeast extract）10g/L、蛋白胨（peptone）20g/L于单/双去离子水中，如制平板加入20g/L琼脂粉(配制固体培养基)；2）高压灭菌 121°C 20min；3 加入20g/L葡萄糖(dextrose或glucose，葡糖糖溶液灭菌后加入、防止与蛋白胨反应)；注：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。

1、活化培养基YPD培养基：10g/L 酵母提取物（yeast extract），20g/L Peptone，20 g/L 甘油。

2、种子培养基BMGY培养基：1％YE，2％peptone，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油，100mM pH6.0磷酸bufferPeptone 20g酵母提取物10g甘油10g溶于700ml双蒸水中，高压灭菌121℃，20min.待冷至室温后，依次加入：1M磷酸钾缓冲液（pH6.0）100ml10X YNB 100ml500X生物素（biotin）2ml混合均匀后使用或者4℃保存。

3、摇瓶诱导培养基BMMY培养基：1％YE，2％peptone，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1%甲醇，100mM pH6.0磷酸bufferPeptone 20g酵母提取物10g溶于700ml双蒸水中，高压灭菌121℃，20min.待冷至室温后，依次加入：1M磷酸钾缓冲液（pH6.0）100ml10X YNB 100ml500X生物素（biotin）2ml10%甲醇100ml混合均匀后使用或者4℃保存。

4、1M磷酸钾缓冲液（pH6.0）：1M磷酸氢二钾132ml1M磷酸二氢钾868ml溶于双蒸水中，用KOH或者磷酸调节pH为6.0，定容至1000ml，高压灭菌121.0℃，20min.,于4℃保存。

5、10X YNB：YNB 13.4g溶于1000ml双蒸水中，用0.2微米的滤膜过滤除菌。

6、500X 生物素：生物素0.2g溶于1000ml双蒸水中，用0.2微米的滤膜过滤除菌。

6、PTM1：(我有配好的)CuSO4·5H2O 6.0g，KI 0.8g，MnSO4· H2O 3.0g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO3 0.2g，CaSO4·2H2O 0.5g，ZnCl2 20g，FeSO4· 7H2O 65g，生物素0.2g，浓H2SO4 5ml用去离子水定容至1L。

实验一培养基的配制及灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。

各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。

在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。

培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。

培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。

一、实验目的1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。

2．明确培养基的配制原理。

3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。

4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。

二、实验原理灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。

消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。

灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实验室中最常用的就是干热灭菌和湿热灭菌。

干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。

但干热灭菌温度不能超过180℃。

否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。

待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。

导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。

1. 查氏培养基--Czapek–Dox Medium蔗糖 30 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g， KCl 0.5 g， MgSO4· 7H2O 0.5 g，FeSO4 · 7H2O 0.01 g，琼脂 15 g，水 1000 mL，并用氢氧化钠调节 pH 至7.2-7.4。

121℃灭菌 20 min，冷却后备用。

液体培养基不加琼脂，用于菌种的扩大培养。

成分:硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL制法: 加热溶解，分装后121℃灭菌20min。

用途: 青霉、曲霉鉴定及保存菌种用。

2. TSB 培养基--牛肉膏蛋白胨培养基：(牛肉膏 5g, 蛋白胨 10g, NaCl 5g, H2O 1000mL, pH 调至 7.2 ~7.4。

)胰蛋白胨 15 g，大豆蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，牛肉膏 5 g，琼脂 15 g，水 1000 mL，并用氢氧化钠调节 pH 至 7.2-7.4。

121℃灭菌 20 min，冷却后备用。

液液体培养基不加琼脂，用于菌种的扩大培养。

3. LB 培养基---细菌基础培养基(Tryptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl 10g, 水1000mL, pH 调至7.2 ~7.4。

)胰蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，水 1000 mL，并用氢氧化钠调节 pH 至 7.2-7.4。

121℃灭菌 20 min，冷却后备用。

液体培养基不加琼脂，用于菌种的扩大培养。

4、soc培养基---改良的LB培养基SOC培养基组份浓度：2% (W/V) Tryptone ，0.5% (W/V) Yeast Extract ，0.05% (W/V) NaCl ，2.5 mM KCl 10 mM MgCl2，20 mM glucose。

点板实验方案●实验准备YPD培养基、YPD固体培养基、灭菌水、5ml EP管、50ml离心管、平板●实验步骤1)菌种活化将待实验的菌株从-80℃拿出，取10-15μL菌液接种至含1.5mL YPD培养基的5ml离心管中。

30℃摇床培养24h左右，至有明显浑浊现象；将菌种转接到小黑瓶或50mL离心管中，每管5ml YPD培养基+50μL菌液（如有需要，可以进行保菌）。

30℃摇床培养12h左右，至有明显浑浊现象。

可再转接活化，视情况而定。

2)平板制备3)调菌体浓度测每个菌种的OD620，将菌种密度调一致。

以1mL最低浓度X1作为标准，其余样采用灭菌的ddH20来稀释至1mL同一菌体密度。

4)梯度稀释采用梯度稀释5倍或10倍的方式，将X1作为第一梯度浓度，混匀后依次稀释5次，（200μL X n+800μL ddH20=X n+1，先全部把无菌水加好）。

5)点板每个样采用2μL的量进行点板，从低浓度向高浓度点样，同一系列无需换枪头。

待液体风干后，盖平板，倒置后放于30℃或40℃培养。

505152535455505152535455 BY x x x x x x BY x x x x x x BY-HO-GFP x x x x x x BY-HO x x x x x x BG2○1x x x x x x BY-HO-GFP x x x x x xBG2○2x x x x x x BY2○1x x x x x xBGp○1x x x x x x BY2○2x x x x x xBGp○2x x x x x x BYp○1x x x x x x●实验注意事项✓一次活化用5mL的EP管，实验前的最后一次活化采用小黑瓶（小白瓶），实验前根据菌株生长情况总共活化2-3次✓菌体活化到OD=1.0左右即可开始实验✓当添加物易挥发时，倒平板及晾干平板的过程中关掉超净台的风，在点板时也最好把风关掉✓按照从低浓度到高浓度的顺序进行点板，中途可以不更换枪头✓记得实验要设置平行组，实验前必须确认好所采用的对照菌是什么以及有几个对照。

北京雷根生物技术有限公司
YPD/YEP 培养基
简介：
YPD 培养基又称YEPD 培养基，可用于多种细菌培养，主要用于酵母常规生长的复合培养基。

Leagene YPD 培养基主要由胰蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖等组成，其浓度比常规LB 培养基高，不含琼脂，经高压灭菌处理。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 加入合适的抗菌素和菌种进行培养。

2、 如需制备平板，加入琼脂后，高压灭菌，待冷却后，加入并加入合适的抗菌素。

注意事项：
1、 注意无菌操作，尽量避免污染。

2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：6个月有效。

相关：
编号 名称 CM0036 Storage YPD/YEPD 培养基 500ml 4℃
使用说明书 1份 编号 名称 CA0005 氨苄青霉素溶液(Ampicillin,50mg/ml) CM0002 LB Lennox 培养基 DH0006 苏木素伊红(HE)染色液 NE0011 CTAB 抽提液 NR0003
Lezol(总RNA 提取试剂) PE0018
SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒 TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD 比色法)。

酵母实验操作方案一．质粒酶切及线性化1）用维特洁日常型小量DNA纯化试剂盒抽提9KSF2，可得到较纯的质粒10μg/3ml菌液，终体积80ul。

2）线性化质粒使用80μl酶切体系9KSF2质粒70μl内切酶（SacI，SalI，BglⅡ）2μl10 x buffer 8μl3）酶切3－16小时，一般3小时即可；二．乙醇回收酶切质粒1）2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC（PH 5.2），混匀，沉淀DNA；2）－200C数个小时（>2小时），13,200rpm离心10～20分钟，吸弃上清；3）300ul 70％乙醇洗一次，13,200rpm离心10分钟，吸弃上清（注意离心管位置，从含有DNA的离心管另一侧吸取）；4）37℃烘干水分和残留乙醇；5）用20μl ddH2O重溶；6）1ul样品电泳检测DNA量，计算DNA总量；三．电转化1．准备感受态细胞1）5ml YPD 接种GS115单菌落，250rpm，300C，摇菌24 hours；2）100ml YPD，接种百分之一，同时留1ml空白YPD，300C ，250rpm，7～8hours，直到OD600＝1.3～1.5；3）菌液转入500ml离心管，JA14，1500g，40C离心5 min，弃上清；4）100ml冰水重悬，同上离心，弃上清；5）80～90ml冰水重悬【50ml】，同上离心，弃上清；6）20ml冰1M sorbitol 重悬【5ml】，然后转移到50ml 离心管中，同上离心，弃上清；7）约150μl 1M sorbitol重悬【250ul】，40C备用，剩下的感受态细胞可以保存在－700C冰箱大约3周。

2．转化1)100μl GS115感受态细胞加入＋20μl 线性化质粒，用枪打匀；2)冰浴5min，加入0.2cm转化杯中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；3) 电转化，参数设定：电压1500V 电容25μF电阻200欧姆，放电时间4～5ms4)立即加650μl 冰1M sorbitol 入转化杯，打匀；5) 迅速涂板，250μl/块MD板，共3块；6) 涂好的板放在300C培养箱中培养4～5天，至菌落直径1mm即可。

常用培养基LB培养基配方Typtone 1%Yeast extract 0.5%NaCl 1%Amp选择培养基加量：50µg/mL Amp。

YPD培养基配方Typtone 2%Yeast extract 1%D-glucose 2%半乳糖培养基Typtone 2%Yeast extract 1%D-galactose 2%抗性培养基抗生素加量：G418：350 μg/ml；Zeocin：150 μg/ml 5-FOA培养基的配置（100mL）①50mL 5-FOA-YNB培养基（过滤除菌）50mL5-FOA 125mgUra 5mgYNB 170mg硫酸铵0.5g脯氨酸100mg葡萄糖2gH2O 50mL②50mL琼脂溶液（高压灭菌）称取2.0g琼脂粉，加入50mL水，高压灭菌。

常用实验方法酵母电转化方法：（1）酵母于YPD平板上活化后，接种3mL YPD液体培养基，30℃200r/min培养8h左右。

（2）取0.1mL种子液转接至30mL新鲜的YPD液体培养基，30℃100r/min继续培养10h 左右，至菌液OD600在1.2~1.5之间。

（3）6000r/min 4℃离心5min收集菌体，用20mL无菌水离心洗涤菌体1次。

（4）用15~20mLDTT溶液重悬菌体，30℃水浴放置60min，6000r/min 4℃离心5min收集菌体。

（5）用20mL 4℃预冷的1M山梨醇溶液重悬菌体，6000r/min 4℃离心5min洗涤菌体。

（6）重复步骤（5）三次，共四次。

（7）用1mL 1M山梨醇重悬菌体，转移至1.5mL离心管，离心后收集菌体，加入与菌体近似等体积的1M山梨醇重悬菌体。

（8）每个转化取80μL菌液，加入10μL转化片段或质粒，20μL鲑鱼精DNA，混匀后转入电击杯，冰上放置5min后，1.5kv电击。

（9）加入0.9mL含山梨醇的YPD培养基将电转液洗出，30℃100r/min复苏2h。