黑曲霉脂肪酶的分离纯化

淮北师范大学信息学院07生物工程实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案设计成员：万纹纹王磊陈晨夏柱宝指导老师：高翔利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选：1、 土壤采样：采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间：采样地点： 环境条件：用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。

应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。

2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。

PDA 培养基配方：马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、310-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。

4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上410-、510-和610-三种稀释度，然后用无菌吸管分别由410-、510-和610-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。

5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d.6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。

孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。

黑曲霉固体发酵工艺及有效活菌数检测作者：2006级生物工程专业刘强指导教师：杜志兵工程师摘要：本实验旨在利用微生物固体发酵技术，以廉价农产品副产物作为发酵培养基,大量制备黑曲霉菌体，用于有机物料腐熟剂的生产，并检测产品的有效活菌数。

首先以济宁三环化工生产用黑曲霉菌种作为原始菌种，采用平板划线技术，进行菌种的分离筛选；将获得的纯系菌株接入豆芽汁液体培养基中，开始摇瓶扩大培养；然后选择合适的摇瓶培养物作为固体发酵菌种，接入固体发酵基质中，进行曲盒发酵；发酵结束后，黑曲霉生产接种量为1‰。

最后对腐熟剂产品依据GB20287-2006农用微生物菌剂标准中有效活菌数的测定方法进行检测。

结果表明，发酵所产黑曲霉在质量和数量上符合腐熟剂生产标准，产品有效活菌数检测结果符合行业标准的规定，且操作规范、重复性高、结果准确可靠。

关键词：固体发酵；黑曲霉；有效活菌数；测定Abstract:This study was designed to use solid microbial fermentation technology to low-cost agricultural by-products as fermentation medium,large scale preparation of Aspergillus niger biomass, decomposition of organic materials used in the production of agents and the number of active bacteria detection products.Jining first to use three-ring chemical production as the original strain of Aspergillus niger strains,using flat crossed technology for Strains;strains will be of purely physical medium access bean sprout juice,began expanding culture flask;and then select the appropriate culture flask as a solid fermentation bacteria,access solid substrate fermentation,fermentation march boxes;fermentation after inoculation of Aspergillus niger producing1‰.Finally,the decomposition agent agricultural products according to GB20287-2006standard microbiological agents Determination of the number of active bacteria were detected.The results show that the fermentation produced by Aspergillus niger in the quality and quantity production standards consistent with decomposition agent,the product number of active bacteria test results meet industry standard requirements,and operating specifications,reproducible,accurate and reliable.Key words:solid state fermentation；Aspergillus niger；effective viable count；determination1前言秸秆、人畜粪便、生活垃圾、工业废渣等各种有机废弃物是数量巨大的可再生资源，绝大部分没被充分有效利用，不仅导致严重的环境污染，而且造成资源的巨大浪费。

黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常用的微生物菌株，可以利用其进行葡萄糖酸钠的发酵生产。

以下是黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠分离纯化工艺的简要流程：
1. 发酵生产：
黑曲霉通过代谢过程，将培养基中的碳源转化为葡萄糖酸钠。

发酵过程中需要控制发酵温度、pH值、氧气供应等因素，以提高产量和质量。

2. 分离：
将发酵液经过离心分离或压滤，将菌体和培养基分离。

分离后的发酵液中含有葡萄糖酸钠、杂质和其他副产物。

3. 过滤：
将分离后的发酵液通过滤器进行过滤，去除大颗粒的杂质，减少后续纯化步骤的负担。

4. 萃取：
使用适当的有机溶剂对过滤后的发酵液进行萃取，将其中的葡萄糖酸钠转移到有机层中。

将有机层与水层分离，得到含有葡萄糖酸钠的有机相。

5. 沉淀：
将有机相中的葡萄糖酸钠转化为钠盐沉淀，可以采用钠碳酸或氢氧化钠等化学物质进行反应。

沉淀后，对其进行过滤和洗涤，得到较为纯净的葡萄糖酸钠固体。

6. 干燥：
将葡萄糖酸钠固体在干燥器中进行干燥，去除其中的水分，得到最终产品。

以上是黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠分离纯化工艺的主要步骤。

在实际操作中，还需要对每个步骤进行具体的优化和控制，以提高产品的产量和质量。

酶的分离纯化方法-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1酶的分离纯化方法摘要酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。

一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。

本文从酶原料选择、酶的分离与纯化、酶纯度的评价三个方面进行总结，列举了一些常用的分离纯化方法。

关键词酶、分离纯化、方法、纯度中图分类号O6酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础。

一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，很少有通用的规律可循。

酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独有的特点：一是酶一般取自生物细胞，而特定的一种酶在细胞中的含量很少；二是酶可以通过测定活力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。

1 酶原料选择提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。

但是由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。

目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。

从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。

2 酶的分离纯化由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。

酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。

在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。

酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。

一、填空题1常用的菌种纯化方法很多，主要有划线分离法、平板分离和稀释分离法。

2产酶菌种的要求安全可靠、产酶性能要稳定、产酶量高和营养要求低。

3常用菌种保藏方法有斜面低温、液石蜡封、固体曲法、沙土管法、冷冻干燥、液氮法。

4控制发酵过程产生泡沫的方法有：选育不易产生泡沫的菌种、调节培养基中营养成分，减少或缓加易起泡的原料、机械消泡或化学消泡5酶发酵的培养方式与其他发酵大同小异，基本上分为固体曲培养法、液体深层培养法6按发酵的操作方式可分分批式反应、连续式反应、流加分批式反应。

7酶的比活力是反应速度的量度指标，酶转换数是量度指标。

1. 用阳离子交换树柱分离AA，在pH=2时，碱性氨基酸和酸性氨基酸相比，哪一个优先被洗脱?2. 细胞破碎的主要方法有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎、酶解破碎。

3. 酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取。

4. 酶浓缩的方法主要有蒸发浓缩、超滤浓缩、脱水浓缩、反复冻融浓缩。

5. 酶干燥的方法主要有冷冻干燥、直接干燥、喷雾干燥。

6. 结晶的方法主要有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、等电点结晶法、蒸发浓缩。

7. 离心方法主要有差速离心、密度梯度离心、等密度梯度离心。

8. 加压膜分离可以分为微滤、超滤、反渗透。

9酶化学修饰的方法酶的表面修饰、酶分子的内部修饰、与辅因子相关的修饰、金属酶的金属取代等。

10酶化学修饰后的性质都发生了怎样的变化热稳定性、抗原性、对各类失活因子的抵抗力、修饰酶在体内的半衰期、最适pH、Km 的变化。

11用带负电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH ，用带正电荷的载体制备的固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH ，用不带电荷的载体制备固定化酶，其最适pH比游离酶的最适pH 。

12.酶电极是由半透膜与酶胶层密切结合的传感装置。

13.氨基酸酰化酶可以催化（）。

A.D,L-氨基酸生成D-氨基酸和L-氨基酸。

B.D,L-乙酰氨基酸水解生成D,L-氨基酸。

脂肪酶产生菌的筛选产酶条件及酶特性研究薛静;陶树兴;田泽英;苏蕊;丛寅【摘要】[ Objective ] To screen high lipase activity strains as strains producing lipase and donor of lipase gene. [ Method ]26 samples were collected,and the strains were isolated through adopting bromcresol purple preliminary screening plate and secon darily screening with shake flask loading fermentation medium. A higher lipase activity strain 09-7-1 was obtained and identified as Aspergillus niger. The factors of influencing lipase production and characterization of the lipase of strain 09-7-1 were researched. [ Result ] The soluble starch in 0. 5％ was the best carbon resource. The yeast extract in a ratio of 0.2％ was the best nitrogen resource. The optimum initial temperature was 32 ℃ ,and the optimum initial pH value was 5.2. The lipase activity of strain 09-7-1 achieved 24. 112 U/ml after optimization from 13. 164 U/ml and was 1. 83 times as high as the initial lipase activity. The best reaction temperature of lipase was30 ℃. The best reaction pH was 7.0,and the activity were no much change in 60 ℃ for90 min and stable from pH 5.5 to pH 10.0. [Conclusion] The study can lay the foundation for study on producing lipaso and lipase gene.%[目的]筛选脂肪酶高活性菌株作为脂肪酶生产菌株和脂肪酶基因的供体菌.[方法]从油脂厂等地采集26份含菌样品,采用溴甲酚紫平板对样品进行初筛,以产脂肪酶发酵培养基摇瓶复筛,获得1株产脂肪酶活性较高的菌株09-7-1,经鉴定该菌株为黑曲霉(Aspergillus niger).采用正交试验对影响该菌株产酶的因素进行了研究,并探讨了该菌株所产脂肪酶的性质.[结果]该菌株最佳产酶条件:碳源为0.5%的可溶性淀粉,氮源为0.2%的酵母膏,培养温度为32℃,发酵液pH为5.2,该菌株最初发酵液中酶活力为13.164 U/ml,优化后酶活力达24.112 U/ml,是最初酶活力的1.83倍.该菌株所产脂肪酶最适作用温度为30℃,最适作用pH为7.0;酶液在60℃保温90 min后,活性损失较少,pH为5.5～10.0内稳定.[结论]该研究可为脂肪酶生产和基因研究奠定基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)015【总页数】5页(P8826-8830)【关键词】脂肪酶;筛选;黑曲霉;产酶条件;酶特性【作者】薛静;陶树兴;田泽英;苏蕊;丛寅【作者单位】陕西师范大学生命科学学院,陕西西安,710062;陕西师范大学生命科学学院,陕西西安,710062;陕西师范大学生命科学学院,陕西西安,710062;陕西师范大学生命科学学院,陕西西安,710062;陕西师范大学生命科学学院,陕西西安,710062【正文语种】中文【中图分类】Q939.97脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3，甘油酯水解酶)为作用于酯键的酶，专门作用于异向系统，可催化天然油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，且优先水解长链酯类产生长链脂肪酸［1］，可以完成水解、酯化、转酯、酯交换及合成等反应，被广泛应用于油脂水解［2］、食品加工、食品品质改良、疾病诊断、催化药物合成［3-4］、皮革生产［5］、可生物降解的无污染洗涤剂的研发［6］和生物柴油的生产［7］等方面。

根癌农杆菌介导脂肪酶在无孢黑曲霉中的高效表达潘力;王云艳;王斌;何攀;李俊星【摘要】黑曲霉(Aspergillus niger)具有高效的蛋白表达和分泌能力.为实现异源蛋白在无孢黑曲霉中的高效重组表达,在优化遗传筛选标记的基础上,建立了根癌农杆菌介导的、以潮霉素抗性基因为筛选标记的黑曲霉转化体系.利用该体系介导米黑根毛霉脂肪酶(RML)转化黑曲霉SH-1,通过PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等确定成功获得了RML的黑曲霉转化子,并通过发酵条件优化实现了RML的高效表达,对硝基苯酚比色法测得转化子酶活最高可达15U/mL,是其在酵母中表达水平的10倍以上.%Aspergillus niger (A. niger) owns effective capabilities of protein expression and secretion. In order to implement the effective recombinant expression of heterologous protein in non-spore A. niger, several selection markers were evaluated and hygromycin B resistance gene was selected to establish an Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)-mediated transformation system of A. niger. Then, Rhizomucor miehei lipase ( RML) was transformed into A. niger SH-1 via the A. tumefaciens-medialed transformation and was verified by means of PCR identification, enzyme activity assay, Ni affinity chromatography and SDS-PAGE. Finally, RML transformants effectively expressing RML protein were obtained after the fermentation optimization. The p-nitrophenol colorimetry results show that the transformants possesses a lipase activity of 15U/mL, which is more than ten times that expressed in yeast.【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)005【总页数】6页(P84-89)【关键词】无孢黑曲霉;根癌农杆菌介导转化;米黑根毛霉脂肪酶;基因表达【作者】潘力;王云艳;王斌;何攀;李俊星【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006;华南理工大学生物科学与工程学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】Q812黑曲霉(Aspergillus niger)是丝状真菌中的重要类群，具有高效的蛋白表达、分泌和修饰能力，被美国食品及药物管理局(FDA)认定为安全菌株，在食品、医药、饲料、工业酶制剂等领域正受到越来越多的关注［1-4］.在基因工程中，外源基因进入黑曲霉细胞后会整合在其染色体上，重组子具有很高的遗传稳定性［5］，有利于异源基因的高效表达，因此黑曲霉作为异源蛋白的重组表达系统日益受到重视.黑曲霉作为表达系统的关键技术是遗传转化方法的建立.根癌农杆菌介导的转化(ATMT)具有操作简便、重复性好等优点［6］，其效率远高于原生质体转化、电转化等传统方法［7］，已成功应用于丝状真菌的遗传转化［8-11］.目前，ATMT 介导丝状真菌转化局限于基因功能研究［6］，钟耀华［12］曾利用 ATMT 转化瑞氏木霉分析其生长代谢突变子.然而，由于遗传筛选标记的限制，利用ATMT介导黑曲霉表达异源蛋白的研究鲜见报道.本研究以在轻工食品行业具有重要应用的米黑根毛霉脂肪酶(RML)为研究对象，在优化遗传筛选标记的基础上，采用根癌农杆菌介导RML表达载体转化无孢黑曲霉，并对转化子表达RML进行初步的发酵条件优化，以期为RML的大规模工业应用奠定基础.1 材料与方法1.1 菌种与质粒无孢黑曲霉SH-1，华南理工大学生物科学与工程学院微生物实验室保藏;根癌农杆菌LBA4404，由广东省农科院惠赠.华南理工大学生物科学与工程学院微生物实验室构建了3种根癌农杆菌工程菌:LBA4404A含pHGW-PT表达载体、潮霉素(HygB)抗性基因、吡啶硫胺素(PT)抗性基因;LBA4404B含pHGW-amdS表达载体、HygB抗性基因、乙酰胺酶基因(amdS);LBA4404C含脂肪酶表达载体pHGWRML、HygB抗性基因、RML基因表达盒(3'端添加His6组氨酸标签)［13］.1.2 培养基根癌农杆菌LC培养基、黑曲霉诱导培养基(IM培养基)、黑曲霉基础培养基(MM 培养基)、乙酰胺培养基参照文献［8］配制.黑曲霉淀粉培养基:牛肉膏3g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉2 g/L，淀粉10 g/L，NaCl 2g/L，琼脂 1.7%，pH=5.5.YPD 培养基:葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L.察氏培养基(CD培养基):蔗糖 20 g/L，硝酸钠 3 g/L，KCl 0.5g/L，MgSO40.5 g/L，K2HPO41 g/L、FeSO4 0.01g/L，琼脂粉 1.5%，pH=5.5.1.3 试剂与仪器HygB购自美国Merck公司;PT、乙酰丁香酮、牛血清白蛋白(BSA)、对硝基苯酚辛酸酯(pNPC)购自Sigma-Aldrich公司;三丁酸甘油酯购自百灵威公司;其它试剂为国产分析纯.主要仪器包括德国Eppendorf公司PCR仪，美国Thermo Scientific SORVALL高速冷冻离心机，美国Bio-RAD公司蛋白、核酸电泳仪，美国Pall公司纯水仪，美国GE公司蛋白质纯化系统AKTATM purifier，瑞士TECAN公司Sunrise多功能酶标仪等.1.4 黑曲霉药物敏感性试验制备100 μg/mL 潮霉素、0.1 μg/mL 吡啶硫胺素的水溶液.参照文献［8］制备含0.01 mol/L乙酰胺的培养基.各取200μL黑曲霉菌种涂布分别加有100μg/mL HygB、0.1μg/mL PT的 CD 固体培养基.取200μL黑曲霉菌种涂布含有0.01mol/L乙酰胺的固体培养基.各取200μL黑曲霉菌种涂布不加上述药物的CD培养基平板，作为对照.30℃培养4天后观察黑曲霉在药物作用下的生长情况.1.5 ATMT法介导的黑曲霉转化体系的建立参照文献［8］报道的转化方法.将在淀粉培养基平板上活化后的黑曲霉单菌落转移至CD液体培养基中34℃培养5天待用.将含有待转化质粒的根癌农杆菌在LC培养基平板(含20 μg/mL利福平和100μg/mL壮观霉素)上活化，挑取较大的单菌落接种于LC液体培养基(含上述药物)，28℃、250r/min培养24 h;取1.5 mL根癌农杆菌培养液离心弃上清，加入5mL IM液体培养基(含5 μL 0.2 mol/L乙酰丁香酮)重悬菌体，28℃、100 r/min避光培养4～5h，待菌体D(600)值为1.0左右时取出待用.将100μL黑曲霉培养物与100 μL根癌农杆菌培养物混合均匀后涂布于含0.2 mmol/L乙酰丁香酮的IM培养基平板上，22.5℃避光培养3天;将培养物转移至含0.2 mol/L头孢噻肟和100 μg/mL潮霉素的MM培养基平板，30℃培养4～6天，待转化子长出后提取基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定，所用引物见表1.1.6 根癌农杆菌介导的脂肪酶RML转化黑曲霉1.6.1 脂肪酶表达载体pHGW-RML转化黑曲霉脂肪酶表达载体pHGW-RML转化黑曲霉的方法参见1.5.筛选标记为HygB抗性基因.1.6.2 RML转化子的PCR鉴定和表观酶活检测将在筛选平板上出现的转化子，用灭菌牙签转接至含0.5%(体积分数)三丁酸甘油酯的CD培养基平板上，30℃培养3～5天，观察转化子周围有无水解圈出现.提取转化子的基因组DNA作为模板，对筛选标记基因、RML基因进行PCR扩增，以鉴定RML表达载体是否已整合在黑曲霉基因组上，所用引物见表1.表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers引物名称引物序列(5'－3')扩增片段长度/bp HygB-forward HygB-reverse解链温度/℃CTTGTTCGGTCGGCATCTAC GTCGCCTAAGGTCACTATCAG 56561166 PT-forward PT-reverse CGATGGAATGGCTAACAGAT TCAAAGACCGTAAGACAAAT 5050 1141 amdS-forward amdS-reverse GGCCCTGAAGGTCGGAT TACTGATGTCTATTGGAAGAAAACT 5555 3430 RML-forward RML-reverse CTGCTTTGGCTGTCCCTATC GGTGACGGCGACCTTGTA 57576441.6.3 RML转化子蛋白的提取及鉴定将在CD培养基(含0.08%琼脂)中培养5～7天的黑曲霉RML转化子菌液经离心浓缩后获得RML转化子种子培养液(D(600)值＞2.0).吸取2mL种子液接种50mL YPD液体培养基，30℃、250r/min振荡培养3天，发酵液用四层擦镜纸过滤除去培养基及菌丝，滤液离心得蛋白粗提液.蛋白粗提液经超滤浓缩并测定浓度后备用.蛋白粗提液的亲和层析纯化参照镍柱产品使用说明及分子克隆方法［14］进行，测定所得RML蛋白样品的浓度，并采用10%分离胶进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测.1.6.4 RML转化子发酵条件的初步优化及脂肪酶酶活测定对转化子表达脂肪酶的发酵优化主要针对3个因素:碳源、温度和pH.碳源选用葡萄糖，用量分别为2%、3%、4%和5%;培养温度分别为30、33和36℃;pH 值选择4.5、5.5 和 6.5.其它培养基成分与 YPD培养基相同，样品于250r/min恒温振荡培养5～8天.自第3天开始取样测定脂肪酶活力，以确定合适的发酵培养条件.脂肪酶活力测定方法:将脂肪酶底物pNPC溶于水中，添加0.5%Triton作乳化剂，经匀浆制备浓度为2.5mmol/L的底物溶液.将500 μL底物溶液、20 μL RML 转化子发酵液和 480 μL 50mmol/L Tris-HCl缓冲液混合，配制1 mL酶活反应体系，于45℃预热后反应10 min，加入20 μL 5%三氯乙酸终止反应.取200μL反应液至96孔板，用酶标仪测定D(405)值.脂肪酶活力单位(U)定义为每分钟水解底物pNPC生成1μmol对硝基苯酚所需的酶量.2 结果与讨论2.1 黑曲霉筛选标记的确定在含100μg/mL潮霉素的CD培养基平板上，黑曲霉SH-1的生长受到完全抑制，而在不加HygB的平板上黑曲霉生长旺盛(见图1(a)、1(b))，说明黑曲霉对HygB敏感.同样，0.1μg/mL的PT可以抑制黑曲霉在CD平板上的生长，而在不加PT的平板上黑曲霉生长正常(见图1(a)、1(c)).因此HygB、PT的抗性基因可以作为黑曲霉遗传转化的筛选标记.在以乙酰胺为唯一氮源的培养基平板上，黑曲霉SH-1生长十分缓慢(见图1(a)、1(d))，说明黑曲霉利用乙酰胺作为氮源的能力较弱.来源于构巢曲霉的乙酰胺酶能有效分解乙酰胺提供氮源，而序列分析表明黑曲霉的乙酰胺酶基因(amdS)与构巢曲霉amdS基因只有22.31%的同源性，导致黑曲霉利用乙酰胺的能力十分有限，这为黑曲霉的遗传转化提供了一个很好的筛选标记.图1 黑曲霉SH-1对潮霉素B、吡啶硫胺素、乙酰胺的生长敏感性Fig.1 Growth sensitivity of A.niger SH-1 tohygromycin B，pyrithiamine and acetamide 2.2 以HygB抗性基因为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系的建立本研究以HygB抗性基因作为筛选标记，利用ATMT法介导表达载体pHGW-PT、pHGW-amdS转化黑曲霉SH-1.在筛选平板上获得4个具有HygB抗性的pHGW-PT转化子(见图2(a))，其在含PT的平板上生长旺盛，而宿主菌基本没有生长(见图2(b))，经PCR扩增在转化子中获得了HygB、PT抗性基因的 PCR产物(见图3(a)、3(b)).pHGW-amdS转化宿主菌得到3个转化子(见图4(a))，其在乙酰胺培养基平板上生长旺盛而野生型宿主菌则生长较差(见图4(b))，经PCR扩增在转化子中得到了HygB抗性基因和amdS基因的PCR产物(见图5(a)、5(b)).以上结果表明，以HygB抗性基因作为筛选标记可以有效地获得转化子，间接证明了PT抗性基因和amdS基因可以作为遗传筛选标记.由此建立了以HygB为筛选标记的黑曲霉遗传转化体系.图2 黑曲霉SH-1的pHGW-PT表达载体转化Fig.2 Transformation of A.niger SH-1 with pHGW-PT expression vector1－4—转化子;5—宿主菌图3 pHGW-PT转化子的PCR鉴定Fig.3 PCR identification of pHGW-PT transformantsM—DNA标准物;1—质粒对照;2－4—转化子;5—宿主菌2.3 黑曲霉RML转化子的鉴定用pHGW-RML表达载体转化黑曲霉后，在含头孢噻肟和潮霉素的筛选平板上出现4个转化子(见图6(a))，将其转移至含三丁酸甘油酯的CD培养基平板，培养5天后转化子菌落周围出现底物水解圈，而宿主菌则没有水解圈(见图6(b))，表明RML基因已在黑曲霉中表达.以所得转化子基因组DNA为模板，经PCR获得了HygB抗性基因、RML基因的PCR产物(见图7(a)、7(b))，将扩增得到的RML基因的PCR产物(644 bp)进行测序，测序结果与RML基因原始序列完全一致，表明所得黑曲霉RML转化子是阳性克隆.由于所用宿主为不产孢子的无孢黑曲霉，有利于根癌农杆菌介导的遗传转化的顺利进行;实验结果证明，转化效率较高.图4 黑曲霉SH-1的pHGW-amdS表达载体转化Fig.4 Transformation ofA.niger SH-1 with pHGW-amdS expression vectorA1、A2、A4—转化子;W—宿主菌图5 pHGW-amdS转化子的PCR鉴定Fig.5 PCR identification of pHGW-amdS transformantsM—DNA标准物;1—质粒对照;2—宿主菌;3—转化子图6 黑曲霉RML转化子的底物水解鉴定Fig.6 Hydrolyzing verification ofA.niger transformants bearing RML gene1－4—RML转化子;5—宿主菌图7 黑曲霉RML转化子的PCR鉴定Fig.7 PCR identification of A.niger RML transformantsM—DNA标准物;1—RML转化子;2—宿主菌;3—质粒对照2.4 RML蛋白的亲和层析及SDS-PAGE鉴定将活化的RML转化子在YPD培养基中培养3天后收集发酵液上清，经超滤浓缩后进行亲和层析，洗脱峰非常明显，说明带有His6组氨酸标签的RML蛋白与镍柱可以牢固结合并有效洗脱，纯化效果较好(见图8(a)).将纯化后的RML蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，在相对分子质量33000处出现了显著的单一目的蛋白条带，与RML蛋白的大小吻合［15］(见图8(b))，因此本研究构建的黑曲霉RML转化子成功表达了重组脂肪酶.图8 重组脂肪酶的亲和层析纯化及SDS-PAGE电泳鉴定Fig.8 Affinity chromatography of recombinant lipase and its verification by SDS-PAGEM—蛋白质标准物;1—宿主菌;2—纯化前蛋白粗提液;3—亲和层析纯化后蛋白样品2.5 黑曲霉RML转化子发酵条件优化丝状真菌的培养温度一般是30℃.本研究选择30、33和36℃ 3个温度梯度进行试验(pH=5.5，葡萄糖用量为2%)，培养时间设定为6天，结果表明30℃培养时黑曲霉发酵液脂肪酶酶活最高(3.3 U/mL)，因此选择30℃作为最适的培养温度.丝状真菌生长pH 值一般选择5.5，本研究选择 4.5、5.5 和 6.5 进行试验(培养温度为30℃，葡萄糖用量为2%)，培养时间设定为6天，结果表明在pH=4.5时，发酵液的脂肪酶酶活最高(6.4 U/mL)，因此选择pH=4.5为最佳pH值.对于碳源(葡萄糖)用量的优化，选择2%、3%、4%和5%4个梯度配制YPD培养基，培养温度和pH按照上述优化后的条件:30℃、pH=4.5.转化子发酵培养至第7天时，葡萄糖用量为5%的发酵液的脂肪酶酶活达到最高(15 U/mL).在培养过程中发现，第4天时葡萄糖用量为2%的发酵液的酶活最高，第5天时葡萄糖用量为3%的发酵液的酶活最高，第6天时葡萄糖用量为4%的发酵液的酶活最高，而在第7天时葡萄糖用量为5%的发酵液的酶活达到最高.推测原因可能是初始葡萄糖浓度过高导致产生“葡萄糖效应”即代谢物阻遏效应，从而影响了基因的表达.因此，在转化子发酵过程中维持培养基中葡萄糖的浓度在一个合适的水平，对于脂肪酶的高效表达十分重要.经优化，用对硝基苯酚比色法测定RML转化子的酶活，其最高可以达到15U/mL，是其在酵母中表达水平(0.3 U/mL［16］、1.4U/mL［17］)的10倍以上.江慧芳等［18］研究表明脂肪酶酶活的测定方法不同会导致测定结果在数值上存在差异，本研究采用的对硝基苯酚比色法测定的脂肪酶酶活在数值上仅为橄榄油－碱滴定法的1%左右.徐苏炜等［19］在毕赤酵母中表达RML基因，用橄榄油－碱滴定法测定的脂肪酶酶活为102U/mL;Brocca等［20］重组表达来源于皱褶假丝酵母的脂肪酶lip1，采用碱滴定法测定的酶活为150 U/mL;将其换算为对硝基苯酚比色法测定的酶活则只有1.02 U/mL和1.50U/mL，远小于本研究获得的重组黑曲霉的脂肪酶酶活，表明黑曲霉重组表达系统是非常有潜力的异源蛋白表达系统.3 结语将植物基因工程的技术应用于丝状真菌，建立了根癌农杆菌介导的黑曲霉转化体系，对提高工业微生物育种效率作了有益的尝试.利用该黑曲霉转化体系表达脂肪酶RML，经PCR鉴定、酶活检测、镍柱亲和层析及SDS-PAGE电泳检测等成功获得了脂肪酶RML的黑曲霉转化子，通过发酵条件优化实现了RML的高效表达，转化子的RML酶活是其在酵母中表达水平的10倍以上，为RML在油脂、食品、生物柴油、医药和日化等诸多领域的应用奠定了基础，也为异源蛋白在黑曲霉中的高效表达提供了研究线索.在此基础上，本研究将利用所获得的脂肪酶开展油脂转化生产生物柴油等工作，为重组脂肪酶的工业应用进行工艺探索.参考文献:［1］ Baker S E.Aspergillus niger genomics:past，present and intothe future 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无抗黑曲霉表达系统构建及脂肪酶的表达黑曲霉作为一种重要的工业生产菌株,已逐步开发成为一种重要的酶表达系统。

在本研究中,首先选择一株低蛋白背景且潮霉素敏感菌株为表达宿主,并对农杆菌介导转化法和PEG-原生质体转化法进行条件优化,然后以脂肪酶为模式酶在黑曲霉中进行同源/异源脂肪酶的表达。

通过转录和转录后水平改造提高了黑曲霉脂肪酶ANL的表达量,并进行了酶学性质研究。

最后初步开展了CRISPR/cas9技术在黑曲霉表达系统中的应用,构建了尿嘧啶缺陷型菌株。

主要结果如下:（1）对农杆菌介导转化和PEG-原生质体转化两种方法进行了条件优化。

优化后农杆菌介导转化的条件是不萌发的新鲜孢子与OD₆₀₀培养至0.9-1.0的农杆菌以1:1的比例混合后,在乙酰丁香酮浓度为200μmol·L^-1的IM平板上,23 ^oC避光培养48 h后进行转膜。

最佳转化效率大约为每10⁶个孢子获得60±5个转化子,并且阳性率保持在90%以上。

原生质体制备条件为:10⁷个?mL^-1黑曲霉孢子接种PDA浸提液,30 ^oC,200 r·min^-1培养24 h,收集菌丝体,按质量体积比1:10加入裂解酶液(0.8 mol·L^-1 MgSO₄,1%纤维素酶,0.5%蜗牛酶,0.25%溶菌酶),37^oC,120 r·min^-1酶解2.5 h后收集原生质体,获得原生质体个数约6.8×10⁵个?mL^-1,原生质体再生率约63±2.5%。

黑曲霉发酵生产α-淀粉酶姓名：汪媛专业：10生物技术学号：10521019 前言：α-淀粉酶能随机地作用于淀粉的非还原端，生成麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，所得产物的还原性末端葡萄糖单位碳原子为α构型，同时该酶能使淀粉浆的粘度下降，因此又称为液化酶。

耐酸性α-淀粉酶是在酸性条件下水解淀粉的酶类，其最适pH在4.0左右。

通过黑曲霉发酵生产α-淀粉酶的实验过程，熟悉发酵罐的构造和使用方法。

初步了解发酵生产的原理和常规发酵参数的检测方法。

整个实验按照“菌种的培养空消实消接种发酵放罐”的发酵过程进行。

在整个发酵的过程中，每隔6h取一次发酵液样品检测其pH值、酶活、残糖量及生物量四个生理指标。

最后将所测数据进行整理、分析，可以得出整个发酵过程各物质的生成和消耗的变化规律以及如何调整培养条件来提高发酵生产的效率，对大工业生产具有重要的指导意义。

关键词：黑曲霉α-淀粉酶发酵pH值酶活残糖量生物量。

一，材料与方法：1.材料:菌种：黑曲霉培养基：已配制好的培养基。

试剂：（1）碘液：称取0.5g I2 和5.0gKI 研磨溶解于少量蒸馏水，定容至100ml，于褐色试剂瓶内保存，避免阳光直射。

（2）稀碘液：取原碘液1ml稀释100倍。

此溶液现配现用。

（3）0.5%淀粉液：称取干燥过的可溶性淀粉0.5克，加5ml缓冲液，搅拌混和，再徐徐倾入70毫升煮沸的缓冲液中。

继续煮沸2分钟，冷却至室温，定容至100mL。

此溶液需要当天配制。

(4) 磷酸缓冲液（pH 6.0）：0.2 mol/L K2HPO4 (12.3mL)+0.2 mol/L KH2PO4(87.7mL)。

(5) 蒽酮试剂。

溶解0.2 g蒽酮于浓硫酸（A. R. 95.5 %）100 ml中，当日配制试用。

具体实验过程中，应视样品分数多少来准备蒽酮试剂的配置量。

2.方法：2.1发酵罐的使用：发酵罐的几大系统，即空气系统、蒸汽系统、补料系统、进出料系统、温度系统、在线控制系统。