最新ELISA实验原理及操作

ELISA方法的基本原理和操作步骤基本原理：1.直接ELISA：直接将酶标记的抗体与待测样品中的抗原结合。

该方法简单，适用于检测高浓度抗原，但不适用于低浓度抗原检测。

2.间接ELISA：先将待测样品中的抗原与特异性抗体结合，随后再加入酶标记的二抗与该特异性抗体结合。

该方法适用于特异性抗体较多的情况，能够提高检测灵敏度。

3.夹心ELISA：利用两种抗体分别与待测样品中的抗原结合，形成夹心复合物。

酶标记抗体与第二个抗体结合的复合物逐渐积累，从而实现对目标分子的定量检测。

4.竞争ELISA：利用酶标记抗体与待测样品中的抗原竞争结合，根据酶标记物对底物的催化反应产生的信号强度来反映待测样品中抗原的浓度。

操作步骤：1.酶标板涂布：取出96孔的酶标板，在每孔中加入特异性抗体，通常用于检测的是抗原，也可以是抗体。

将酶标板在4°C下孵育数小时或过夜，使抗体吸附在孔壁上。

2.冲洗：倒掉孔内液，用PBS-T洗涤缓冲液冲洗3-4次，去除未结合的抗体。

3.阻断：加入阻断缓冲液如5％的牛血清白蛋白(BSA)或非脂乳粉，防止非特异性结合。

4.样品加入：加入待测样品、标准品或对照样品，使待测物质与固相抗体结合。

5.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的样品。

6.酶标记抗体：加入酶标记的二级抗体，即酶联检测剂。

7.洗涤：冲洗孔内液，去除未结合的酶标记抗体。

8.底物加入：加入底物，底物受到酶标记的物质的催化，会产生信号。

9.反应停止：加入反应停止液，终止底物的反应。

10.读取结果：通过酶催化底物反应的产物颜色的变化，利用酶标仪读取OD值，反映抗原或抗体的浓度。

elisa检测方法的原理（酶联免疫吸附试验）【实验原理】酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）的基本原理是：由于抗原、抗体的反应在一种固相载体——聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去游离的反应物，从而保证实验结果的特异性与稳定性，且最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化效率很高，从而使该测定方法具有高敏感度。

具体的方法较多，有用于检测抗体的间接法（图8-1）、用于检测抗原的双抗体夹心法（图8-2）以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。

比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。

图8-1 ELISA间接法图8-2 ELISA双抗体夹心法【材料与仪器】1. 包被缓冲液（pH9.6的0.05mol／L碳酸盐缓冲液）、洗涤缓冲液（pH7.4的0.15mol／LPBS）、底物缓冲液（pH5.0柠檬酸－磷酸氢二钠）、终止液2mol／LH2SO4、抗原、抗体及酶标记抗体、正常人血清和阳性对照血清、TMB。

2. 聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔、ELISA检测仪、50μl、100μl微量加样器、塑料滴头、小毛巾、洗涤瓶、小烧杯、玻璃棒、试管、吸管、量筒等。

3.4℃冰箱、37℃孵育箱。

【实验方法】一、ELISA间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为：利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。

1. 包被固相抗原：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。

次日弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min，除去未结合的抗原及杂质。

2.加待检标本：加一定稀释度的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min，除去未结合的抗体及杂质。

elisa检测实验报告ELISA 检测实验报告一、实验目的本次 ELISA 检测实验的目的是定量检测样本中特定抗原或抗体的浓度，以评估实验对象的生理或病理状态。

二、实验原理ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种基于抗原抗体特异性结合反应的免疫测定技术。

其基本原理是将已知的抗原或抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微孔板）表面，然后加入待检样本，样本中的待测抗原或抗体与固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。

接着，加入酶标记的第二抗体（或抗原），形成抗原抗体酶标记抗体复合物。

最后，加入底物，酶催化底物反应生成有色产物，通过测定有色产物的吸光度值，即可定量分析样本中待测抗原或抗体的浓度。

三、实验材料与设备1、试剂包被缓冲液（碳酸盐缓冲液，pH 96）封闭液（含 1% 5% 牛血清白蛋白的 PBS 缓冲液）洗涤液（含 005% Tween-20 的 PBS 缓冲液）样本稀释液（PBS 缓冲液）标准品（已知浓度的抗原或抗体）酶标记的二抗（辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记）底物溶液（如 TMB 或 pNPP）终止液（如 2M 硫酸或 1M 氢氧化钠）2、仪器与设备酶标仪（能够读取 450nm 或 492nm 波长的吸光度值）恒温培养箱移液器（量程分别为20μL、200μL、1000μL）聚苯乙烯微孔板离心机四、实验步骤1、包被将已知浓度的抗原或抗体用包被缓冲液稀释至适当浓度。

向聚苯乙烯微孔板的每孔中加入100μL 稀释后的包被液，4℃过夜或 37℃孵育 2 3 小时。

2、封闭倒掉包被液，用洗涤液洗涤微孔板 3 次，每次浸泡 3 分钟，然后拍干。

每孔加入200μL 封闭液，37℃孵育 1 2 小时。

3、加样倒掉封闭液，用洗涤液洗涤微孔板 3 次，然后拍干。

将待检样本和标准品用样本稀释液进行梯度稀释。

向微孔板的每孔中分别加入100μL 稀释后的样本和标准品，空白对照孔加入100μL 样本稀释液。

37℃孵育 1 2 小时。

ELISA原理及步骤ELISA，即酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay），是一种常见的免疫学实验技术，在生物医学研究和临床诊断中广泛应用。

它基于抗原与抗体的特异性结合，在酶的催化下，通过颜色的变化来检测和定量分析目标分子的存在。

一、ELISA原理1.包被：将抗原或抗体固定在微孔板表面。

2.孵育：加入待测标本，使抗原和抗体充分结合。

3.清洗：去除未结合的物质。

4.检测：加入酶标记的抗体或底物，与已结合的抗原或抗体反应。

5.测定：加入底物后，产生可测量的信号，如颜色变化。

6.分析：对信号进行测量和定量分析。

二、ELISA步骤1.准备试剂和材料：-抗原或抗体：根据需要选择合适的抗原或抗体。

-微孔板：常用的是96孔或384孔微孔板。

-缓冲液：包括洗涤缓冲液、稀释缓冲液等。

-酶标记二抗和底物：根据需要选择适合的酶标记二抗和底物。

2.包被抗原或抗体：-将抗原或抗体稀释至合适的浓度。

-加入微孔板孔中，使其吸附在孔底。

-孵育在4℃或37℃下，一般需要数小时或过夜孵育。

3.添加标本和控制样品：-将待测标本和控制样品逐孔加入微孔板中。

-孵育一段时间，使抗原和抗体发生特异性结合。

4.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。

-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。

5.加入酶标记二抗：-将酶标记的二抗加入每个孔中。

-孵育一段时间，使其与已结合的抗原或抗体结合。

6.洗涤：-倾倒试剂，并洗涤孔内的非特异性吸附物。

-重复该步骤2-3次，以确保洗涤干净。

7.加入底物：-加入适合的底物。

-孵育一段时间，使底物与酶发生反应。

8.反应停止：-加入适当的溶液，停止底物酶反应。

9.测定信号：-使用光密度测定仪读取每个孔的吸光度。

-记录吸光度值，用于后续数据分析和定量结果。

三、ELISA的注意事项-实验过程中需严格控制温度和时间，尤其是孵育和洗涤步骤。

-各个试剂需事先准备好，避免其中一步骤时间过长导致信号的变化。

elisa四种方法原理
ELISA（免疫酶联免疫吸附实验）原理：
ELISA（免疫酶联免疫吸附实验）是一种常见的免疫检测技术，可用于检测抗原（病原微生物或其产物）或抗体（就是人体免疫合成的抗体）。

ELISA技术是由美国科学家Engvall和 Perlmann在1971年开发的。

其原理是用待检样品中特异性的抗原或抗体，经过酶标记或免疫吸附后，与特异性的抗体或抗原结合，形成特异性的复合物，然后用酶试剂和酶色物质，利用酶-物质反应的特异性相互作用，使用特异性发光来检测复合物，从而实现抗原或抗体检测的目的。

ELISA可以分为四种：
1、双抗体免疫吸附ELISA法：在试剂盒中，将抗原（如病毒）固定在培养皿内，然后用一抗原特异性的抗体将抗体特异性的抗体结合起来；最后，添加特异性的抗体作为酶色原料，重复几次，即可得出检测结果。

2、双抗原免疫吸附ELISA：该法与上述方法类似，只是将抗原替换为特异性的抗体，而其余程序不变。

3、原位抗原免疫吸附ELISA：该方法与上述两种方法类似，但是在结合的特异性抗体上加入特异性的抗原，并将其结合在一起，用酶试剂和酶色物质来检测抗原-抗体复合物。

一．ELISA实验原理：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。

再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。

此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

二．实验材料与试剂配制：1.仪器与材料：酶标仪（使用前预热30分钟），微量加液器、吸头、蒸馏水或去离子水，滤纸。

2. 洗液的配制：按1:30的比例配制洗液备用。

三．样品收集、处理及保存1）.细胞培养上清：适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。

用无菌管收集细胞上清液，以1000×g离心15分钟，收集上清。

2）细胞：用PBS反复洗涤细胞3次，调整细胞浓度达到104-106/ml 左右，通过反复冻融，使细胞破坏并放出细胞内成份，或者细胞超声粉碎，离心取上清液检测。

3）血清：在室温下，血液自然凝固，以1000×g离心15分钟，取上清待测。

4）血浆：应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合后静置10-20 分钟后，以1000×g离心15分钟，收集上清。

5）体液：包括胸腹水、脑脊液，分泌物等。

使用不含热原和内毒素的离心管收集，以1000×g离心15分钟，收集上清。

6.）组织标本：切取组织标本，称取重量0.5mg，加入500ul 的PBS，用手工或匀浆器，或超声破碎仪将标本匀浆，以2000-3000 rmp离心20 分钟，收集上清进行检测。

样品中不能含有NaN3，因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

elisa实验原理及注意事项：
一、实验原理
1.包被：抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，原因是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反应等免疫活性：
2、标记：抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点：
3、显色：酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。

二、注意事项
1、每个样本量收集体积=100ulx检测种类，如果要做复孔，标本量收集体积=100ulx检测种类x2；
2、样本收集后若在一周内进行检测可保存于2-8°C，若不及时检测，请进行分装，冻存于-20°或-80°C，避免反复冻融；
3、试剂盒的检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本。

4、血清标本采集是应注意避免溶血，红细胞溶解是会释放出具有过氧化物酶活性的物质，溶血标本可能会增加非特异性显色；
5、为了保证尿液检测的准确性，必须正确收集尿液标本和保存，收集尿液的容器必须要清洁干燥，最好使用一次性的容器，避免因用药并清洁不到而造成的污染，尿液样本必须新鲜，留取后，应及时检测或保存；
6、标本宜在新鲜是检测如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。

如在冰箱中保存过久，其中可能发生聚合，间接法ELISA中乐视本底加深；
7、反复冻融会使蛋白效价降低，所以待测样本如需多次检测，宜少量分装冻存；。

ELISA原理方法及操作细节一、ELISA的原理1.直接ELISA：将抗原直接附着在固相载体上，通过特异性抗体的结合来检测抗原的存在和浓度。

2.间接ELISA：将已知的抗原附着在固相载体上，再加入待测样品，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗体的存在和浓度。

3.夹心ELISA：分别在固相载体上附着抗原和特异性抗体，再加入待测抗原，通过特异性抗体和二抗的结合来检测抗原的存在和浓度。

4.竞争ELISA：将已知抗原和酶标记的抗原竞争与待测抗原中的特异性抗体结合，通过酶标记抗体的含量来反映待测抗原的浓度。

二、ELISA的方法以下以间接ELISA为例进行详细介绍ELISA的方法步骤：1.固相吸附：将已知抗原溶液加入微孔板孔中，使抗原吸附在孔壁上。

然后用PBS或BSA溶液冲洗孔板孔，以去除未结合的抗原。

2.阻断：加入BSA或牛血清蛋白溶液等阻断剂，封闭孔壁上的非特异性结合位点。

3.添加待测样品：加入待检测的抗体样品，经过适当的孵育后，将孔板洗涤，去除未结合的抗体。

4.加入检测抗体：加入与待测抗体特异性结合的二抗，如抗人IgG的辣根过氧化物酶（HRP）二抗，HRP会与抗体特异性结合，形成复合物。

5.反应缓冲液：加入含有HRP底物的反应缓冲液，允许HRP催化底物，产生荧光或颜色反应。

6.反应停止：加入止反应剂，停止酶反应，停止颜色的产生。

7.读取结果：使用酶标仪或光密度计测量各孔中的荧光或颜色的强度，根据强度值的差异来判断样品中抗原或抗体的存在和浓度。

三、ELISA的操作细节1.实验前准备：准备所需试剂、材料和设备，并确保其干净和无菌。

2.微孔板处理：在操作前检查微孔板的孔是否完整，边沿是否正常。

可事先进行热处理或使用已经处理好的微孔板。

3.孔的布置：根据需要设置对照孔和待测孔，每种样品应设置多个孔位，以保证实验的可靠性。

4.液体处理：液体的加入和去除要注意均匀和充分，特别是在液体去除时需要彻底排空。

5.孔板洗涤：洗涤液的选择要注意是否会影响特异性结合和反应的准确性，同时洗涤液的温度和洗涤次数也需要严格控制。

ELISA实验原理及操作ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测和定量分析特定分子（如蛋白质、抗原、抗体等）的存在和浓度。

ELISA实验基于特异性抗原-抗体相互作用的原理，其中酶被用作信号发生器。

以下将详细介绍ELISA实验的原理和操作步骤。

实验原理：1.吸附：首先，将待检测物质（如抗原、抗体等）稀释并加入到孔板（通常是96孔板）中的孔中。

然后，将孔板在低温条件下孵育，使待检测物质与孔壁结合。

2.结合：在吸附步骤完成后，孔板中存在未结合的部分空白孔。

这些空白孔将被添加特异性的第二抗体或标记物与待测物质的结合进行识别。

当第二抗体结合到待测物质时，会形成一个抗原-抗体-第二抗体（或标记物）复合物。

3.检测：根据所使用的标记物的不同，有两种常用的检测方法：酶标方法和荧光方法。

在酶标方法中，标记物通常是酶，如HRP（辣根过氧化物酶）或AP（碱性磷酸酶）。

标记物可以与底物反应，产生一个可检测的信号。

通过加入特定的底物和染色物质，可以检测到酶的活性，从而确定待测物质的存在和浓度。

操作步骤：1.准备试剂和设备：如溶液、洗涤缓冲液、酶标板、吸液管、微量分注器、孔板读数仪等。

2.样品制备：将待测物样品适当稀释，并添加到孔板中。

正样和阴性对照也需相应加入。

每个样品应有至少两个孔。

3.孔板处理：将孔板置于4°C的冰箱中孵育一段时间，使待测物与孔壁结合。

然后，将标准物质和对照物质加入到孔板中的相应孔中。

4.吸除样品：将孔板倒置，并使用洗涤缓冲液洗涤孔壁上未结合的物质。

5.结合抗体：加入特异性的第二抗体或标记物，使其与待测物结合。

6.吸除未结合的抗体：用洗涤缓冲液洗涤孔壁上未结合的抗体。

7.信号发生：加入底物和染色剂，允许酶与底物反应，生成可检测的信号。

8.读取结果：使用孔板读数仪测量各孔的吸光度，并将其转化为待测物浓度。

需要注意的是，每个实验都应包括阴性对照、阳性对照和标准曲线。

ELISA原理方法及操作细节ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的免疫学实验方法，用于定量或定性检测特定抗原或抗体的存在。

ELISA方法简单、灵敏、高效，并且可以在多个领域应用，如医学诊断、药物筛选等。

下面将详细介绍ELISA的原理、方法及操作细节。

一、原理：1.涂布：将待检测的抗原或抗体溶液均匀地涂布在固相载体（如96孔板）上。

2. 靶抗体结合：将Biotin标记的靶抗体加入孔内，与涂布的抗原或抗体特异性结合。

3.洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的物质。

4. 标记物-酶结合：将辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP）加入孔内，与靶抗体的生物素标记位点结合。

5.再次洗涤：用洗涤缓冲液洗去未结合的标记物-酶。

6.底物反应：加入底物，酶催化底物发生颜色反应。

7.反应停止：加入反应停止液，停止底物的反应，生成的颜色与待测抗原或抗体的浓度成正比。

8.检测：用酶标仪测定反应产生的颜色强度，根据已知标准曲线得出待测样品中抗原或抗体的浓度。

二、方法及操作细节：1.准备实验材料：包括96孔板、洗涤缓冲液、稀释缓冲液、标准品、抗原或抗体、探针和底物等。

2.板涂布：将待测抗原或抗体溶液加入96孔板中，保持平衡涂布，可以在4℃下过夜或室温下孵育2小时。

3.洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，轻轻振动去除非特异性结合物。

4.添加靶抗体：将靶抗体加入孔内，孵育一定时间，通常为1小时，用稀释缓冲液来稀释靶抗体。

5.再次洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，洗去未结合的靶抗体。

6. 加入标记物-酶：将Streptavidin-HRP加入孔内，与靶抗体的生物素标记位点结合，孵育一定时间。

7. 再次洗涤：将洗涤缓冲液加入孔内，洗去未结合的Streptavidin-HRP。

8.底物反应：将底物加入孔内，酶催化底物发生颜色反应，孵育一定时间。

9.反应停止：加入反应停止液，停止底物的反应，生成的颜色停止变化。

ELISA 原理－－操作规则（新手适用）一．实验目的酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA）是在免疫酶技术（immunoenzymatic techniques ）的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA 过程包括抗原（抗体）吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体（抗原）, 再加相应酶标记抗体（抗原）, 生成抗原（抗体）－－待测抗体（抗原）－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。

借助分光光度计的光吸收计算抗体（抗原）的量。

待测抗体（抗原）的定量与有色产物成正比。

二．实验原理用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。

常用于ELISA 法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。

由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。

辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素（protonhemin ）区作辅基。

酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。

氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是（已知HRP的A（1cm 403nm 1%）＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml 含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml 计算是HRP的A（1cm 403nm mg/ml=2.5 ）HRP纯度（RZ）=A403nm/A275nm纯度RZ（Ｒeinheit Zahl ）值越大说明酶内所含杂质越少。

高纯度HRP的RZ值在 3.0 左右，最高可达 3.4 。

用于ELISA 检测的HRP的RZ值要求在 3.0 以上。

ELISA 的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。

ELISA原理及步骤ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，酶联免疫吸附法）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的分析技术。

它基于免疫学原理，通过检测特定抗原和抗体的结合来定量测定目标物。

1.直接ELISA的原理及步骤：直接ELISA方法适用于已知抗体，且目标物的抗原性较好的情况。

该方法将特异性的抗原通过硫酸盐或其他方法固定于微孔板上，然后用荧光素标记的抗体与其结合，最后通过测量荧光素的荧光强度来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。

3）加入荧光素标记的抗体，与抗原特异性结合。

4）洗涤净化微孔板以除去未结合的荧光素标记的抗体。

5）加入底物，并进行发光强度测定。

6）测量荧光素的荧光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。

2.间接ELISA的原理及步骤：间接ELISA方法适用于已知抗原，但目标物的抗原性较差的情况。

该方法在抗原固定之后，加入绕行适体素标记的次级抗体，通过该次级抗体与目标物特异性结合，最后通过测量标记抗体的发光强度来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将非特异性结合位点封闭，以防止非特异性结合。

3）加入特异性的初级抗体与目标物结合。

4）洗涤净化微孔板以除去未结合的初级抗体。

5）加入绕行适体素标记的次级抗体，使其与初级抗体结合。

6）洗涤净化微孔板以除去未结合的次级抗体。

7）加入底物，并进行发光强度测定。

8）测量标记抗体的发光强度，利用标准曲线计算样品中目标物的浓度。

3.竞争ELISA的原理及步骤：竞争ELISA方法适用于已知抗体和已知抗体与抗原的结合关系的情况。

该方法将标记抗原与固定抗原共同加入到微孔板中，通过测量标记抗原与抗体的竞争情况来进行定量测定。

步骤：1）将抗原分散涂布在微孔板上，然后孵育，使其与货物绑定。

2）将标记抗原共同加入到微孔板中。

ELISA原理：利用抗原抗体的特异性反应，结合酶对底物的高效催化作用，来检测靶蛋白的含量。

实验时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，通过检测分子（酶或荧光基团），将化学信号转换为电信号，以OD值或发光值的结果，对靶蛋白进行定量分析。

具体原理：ELISA的基础是抗原或抗体的酶标记，利用结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。

再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。

此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

分类：①直接法（Direct ELISA）：直接法将抗原或抗体固定到酶标板上，用带有酶标记的一级抗体或一级抗原，与之特异性结合，再利用酶催化底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。

②间接法（Indirect ELISA）：间接法常用于检测抗体。

将抗原固定到酶标板上，加入一抗，与抗原特异性结合，再加入带有酶标记的二抗，使二抗与一抗特异性结合，最后加入底物，使底物与酶反应显色，即可测定总靶标蛋白的含量。

③夹心法（Sandwich ELISA）：夹心法分为双抗体夹心法和双抗原夹心法，适用于检测具有多个识别位点的大分子蛋白等。

双抗体夹心法ELISA：此方法常用于检测抗原。

将抗体固定在固相载体上，加入待测抗原，与抗体特异性结合，再加入酶标抗体检测，并利用底物显色，即可测定总靶标蛋白的含量。

ELISA实验原理方法仪器流程图和注意事项分析ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay），即酶联免疫吸附法，是一种常用的免疫学检测方法。

该方法通过检测抗原与抗体间的特异结合反应来确定样品中特定抗原或抗体的存在与数量。

ELISA技术广泛应用于生物医学和生物化学领域，如病原微生物检测、药物筛选、分子生物学等。

一、ELISA实验的原理方法：1.抗原或抗体的固定：在试验板上的孔中固定特定的抗原或抗体。

这样，待测样品中的特定抗体或抗原与固定的分子结合，形成复合物。

2.特异性抗体或抗原的添加：将待测样品加入试验孔中，特异性的酶标记抗体或抗原与复合物结合形成特异结合。

3.酶标记抗体或抗原的添加：在第二步形成的特异结合物上加入酶标记抗体或抗原，使其与特异结合物再次发生反应。

4.酶标记分子的检测：添加底物，通过底物的转化反应，观察酶标记物的生成并测定其中的酶活性。

底物催化生成的产物含有染色体，可以用光谱仪检测反应的光密度。

5.检测结果的判定：根据光密度的变化来判断待测样品中特定抗体或抗原的含量，常用的方法包括比色法、荧光法和化学发光法等。

二、ELISA实验的仪器：1.酶标仪或光谱仪：用于测定酶标物产生的光密度或荧光信号。

2.孵育箱：提供恒定的温度和湿度条件，进行酶反应过程。

3.洗板机：用于洗涤试验板以去除非特异性结合部分。

4.加液器：用于添加试剂和样品。

5.显微镜：用于观察试验结果。

三、ELISA实验的流程图：1.将特定抗原或抗体固定在试验板上的孔中。

2.加入待测样品，并与固定的抗原或抗体反应。

3.洗涤试验板，去除非特异性结合的物质。

4.加入酶标记抗体或抗原，形成特异结合。

5.洗涤试验板。

6.加入底物，观察酶标物的生成并测定其酶活性。

7.根据底物转化产物的光密度变化，判定待测样品中特定抗体或抗原的含量。

四、ELISA实验的注意事项：1.使用纯净的试剂和无菌的操作条件，以避免实验结果的偏差。