乳糖操纵子

（三）Lac阻遏物的作用---负调控 Lac阻遏物的作用---负调控 阻遏物的作用---
（三） Lac阻遏物的作用---负调控 Lac阻遏物的作用---负调控 阻遏物的作用--阻遏基因 DNA
I
pol P
O
Z
Y
A
mRNA
阻遏蛋白
没有乳糖存在时
DNA
Fra Baidu bibliotek
I
pol P
O
Z
Y
A
mRNA
mRNA
启动转录
一、乳糖操纵子 (lactose operon)
乳糖确实可诱导Lac mRNA的合成 乳糖确实可诱导Lac mRNA的合成
安慰诱导物（ 安慰诱导物（gratuitous inducer） inducer）
◆结构基因顺序 J.Lederberg 1948 不同Lac 不同Lac-突变型 lacZ+Y+A+/ lacZ-Y+A+ 细菌结合转移和转导试验 证明三基因紧密连锁
说明： 说明： 合成特异的阻遏物，无诱导物时可阻止Z ◆ I+合成特异的阻遏物，无诱导物时可阻止Z基 因表达，诱导物可作为阻遏物的拮抗物， 因表达，诱导物可作为阻遏物的拮抗物，使阻 遏物失活 产生无活性阻遏物，因而无需诱导物Z ◆ I-产生无活性阻遏物，因而无需诱导物Z基因 就可表达 ◆ I+ 对I-显性
两个矛盾
◆第一个诱导物如何进入细胞？ 第一个诱导物如何进入细胞？
第一个β 半乳糖苷酶如何产生？ ◆第一个β-半乳糖苷酶如何产生？ 解释： 解释： 本底水平表达
（四）CAP-cAMP复合物在乳糖操纵子表达中 CAP-cAMP复合物在乳糖操纵子表达中 的作用-------乳糖操纵子的正调控 的作用----乳糖操纵子的正调控 1965年 1965年， Sutherland 发现 大肠杆菌培养液中葡萄糖的含量总是与cAMP 大肠杆菌培养液中葡萄糖的含量总是与cAMP 含量成反比 1968年 1968年，发现 大肠杆菌培养液中加入cAMP cAMP可增加半乳糖苷 大肠杆菌培养液中加入cAMP可增加半乳糖苷 酶的产量
O基因组成型突变
基 因 型 永久表达 诱导表达
O+Z+ OcZ+ OcZ+/O+Z+ OcZ－/O＋Z+ OcZ+/O＋Z－
＋ ＋
－
＋
＋ ＋ ＋ -
说明： 显性， 说明： Oc对O+显性，但只对其临近的基因才有作 用，顺式显性
操纵基因的结构
-7---+28，以+11为对称轴 ---+28， +11为对称轴 +28 典型特征具有反向重复序列 相互作用位点可以缩小在+5----+17 +5---相互作用位点可以缩小在+5----+17
Mutations in protein-coding gene sequences mapped gene locations: ◆ lacZ (β-galactosidase) knock-out mutants inhibit function β of lactose permease (lacY) and transacetylase (lacA). ◆ lacY (lactose permease) knock-mutants inhibit function of transacetylase (lacA), but do not affect β-galactosidase (lacZ). ◆ lacA (transacetylase) knock-out mutants do not affect βgalactosidase (lacZ) or lactose permease (lacY). ◆ Conclusion: 3 lac operon genes are linked in the following order: lacZ codes β-galactosidase lacY codes lactose permease lacA codes transacetylase
Lac阻遏物 Lac阻遏物
Lac阻遏物 Lac阻遏物 结构特点 由基因I 由基因I编码生成的蛋白质 具有四级结构的蛋白质 具有4个相同亚基， 具有4个相同亚基，每个亚基中都有一 与诱导剂和O 与诱导剂和O基因结合的位点 Lac阻遏物与 基因结合： 阻遏物与O Lac阻遏物与O基因结合： 结构基因关闭 调控机制 阻遏物与诱导剂结合： 负调控） Lac阻遏物与诱导剂结合 （负调控） Lac阻遏物与诱导剂结合： 不与O基因结合， 不与O基因结合，结构基因开放 RNA聚合酶结合 聚合酶结合， RNA聚合酶结合，转录开始
AUG：+39 — +41 ：
84-----+ Promotor: -84---+ 1 ---+28 Operator: -7---+28 两者有7bp重叠， 7bp重叠 两者有7bp重叠，使这段序列可能无法同时结合 RNA聚合酶和阻遏蛋白 也可能虽然可以同时结合， 聚合酶和阻遏蛋白， RNA聚合酶和阻遏蛋白，也可能虽然可以同时结合， 但无法形成开放的转录起始复合物
Order of controlling elements and genes: lacI: promoter-lacI-terminator operon: promoter-operator-lacZ-lacY-lacA-terminator
-47 — -84
-47 — -8
-3 — +21
-54 —-58 -65 —-69
I基因产物及其功能 1967年 ◆1967年 W.Gilbert 和B.Miller Hill E.coli细胞提取物分别与放 lac I+ 或lac I- E.coli细胞提取物分别与放 射性标记的IPTG混合，发现lac IPTG混合 E.coli细胞 射性标记的IPTG混合，发现lac I+ E.coli细胞 提取物中有某种蛋白质可以与IPTG结合， IPTG结合 提取物中有某种蛋白质可以与IPTG结合，且每 个蛋白分子可以与4 IPTG分子结合 分子结合， 个蛋白分子可以与4个IPTG分子结合，而lac IE.coli细胞提取物中没有这种蛋白质与IPTG结 细胞提取物中没有这种蛋白质与IPTG E.coli细胞提取物中没有这种蛋白质与IPTG结 说明与IPTG结合的蛋白是I IPTG结合的蛋白是 合，说明与IPTG结合的蛋白是I基因的产物
操纵子突变
操纵基因的组成型突变(顺式显性 顺式显性) （1） Oc 操纵基因的组成型突变 顺式显性 ） 顺式显性突变（ ）：操纵基因只控制临近基 顺式显性突变（cis-dominance）：操纵基因只控制临近基 ）： 对其他等位基因无作用，或者显性效应只对处于同一染 因，对其他等位基因无作用，或者显性效应只对处于同一染 色体上它所调控的结构基因才起作用的现象。 色体上它所调控的结构基因才起作用的现象。 阻遏蛋白不可诱导性突变， （2）lacIS 阻遏蛋白不可诱导性突变，阻遏蛋白失去诱导物 ） 结合位点；超阻遏突变体。 结合位点；超阻遏突变体。 （3）lacI- 阻遏蛋白不能形成寡聚物 ） 阻遏蛋白不能和DNA结合，且呈负互补 反式显 结合， （4）lacI-d 阻遏蛋白不能和 ） 结合 且呈负互补(反式显 性) 等位基因间的互补（ 等位基因间的互补（interallelic complementation）。 ） 负的 负 的 互 补 （ negative complementation ） ： lacI-d 的 产 物和 lacI+的产物组成多聚体时，阻遏蛋白无活性。也称为反式显 的产物组成多聚体时， 阻遏蛋白无活性。 性（trans-dominant）。 ）
结构
调控基因 控制位点
I
结构基因
Y a DNA
阻 遏 蛋 白
P O Z （－7~＋ ） （－ ＋28） 启 操
动 序 列
纵 序 列
半 乳 糖 苷 酶
通 透 酶
乙 酰 基 转 移 酶
β β β β
结
位点
结
位点
（－67~－59） － ） （－
General organization of the lac operon of wild-type E. coli.
(一)乳糖操纵子的发现： 乳糖操纵子的发现： ◆酶的诱导 葡萄糖充分时： 葡萄糖充分时： 葡萄糖代谢有关的酶基因--葡萄糖代谢有关的酶基因---表达 ---表达 其他糖代谢有关的酶基因-----关闭 其他糖代谢有关的酶基因---关闭 葡萄糖耗尽时, 葡萄糖耗尽时,乳糖存在 ---表达 乳糖代谢有关的酶基因 ---表达 葡萄糖代谢有关的酶基因-----关闭 葡萄糖代谢有关的酶基因---关闭
cAMP的作用： cAMP的作用： 的作用 刺激多种可诱导的操纵子。 刺激多种可诱导的操纵子。 cAMP和CAP结合后发挥作用 结合后发挥作用。 cAMP和CAP结合后发挥作用。 CAP（分解物基因激活物蛋白） ◆ CAP（分解物基因激活物蛋白） 有二个相同亚基的蛋白质 一个与DNA结合的domain DNA结合的 一个与DNA结合的domain 一个与cAMP结合的domain cAMP结合的 一个与cAMP结合的domain CAP和cAMP结合后 刺激操纵子, 结合后, ◆ CAP和cAMP结合后,刺激操纵子, 导致结构基因转录(正调控) 导致结构基因转录(正调控)
◆
葡萄糖
cAMP
Lac操纵子被抑制 Lac操纵子被抑制
+ + + + 转录 DNA
CAP
P
O
Z
Y
A
CAP CAP CAP CAP
无葡萄糖， 无葡萄糖，cAMP浓度高时 浓度高时
CAP
有葡萄糖， 有葡萄糖，cAMP浓度低时 浓度低时
原核生物基因表达的一般情况 （乳糖操纵子） 乳糖操纵子）
基因表达的外界信号 基因表达的负调控 基因表达的负调控 基因表达的正调控 基因表达的正调控 正、负调控协同表达 葡萄糖、乳糖浓度的变化 葡萄糖、 Lac阻遏物 阻遏物与操纵基因 Lac阻遏物与操纵基因 cAMP+CAP与相应的DNA序列 与相应的DNA cAMP+CAP与相应的DNA序列
的离体反应液（ lac I+ 的离体反应液（35S标记 基因的产物）与不同的DNA 的I基因的产物）与不同的DNA 分子相互作用，发现I 分子相互作用，发现I基因的产 物不与失去lac lac操纵子全部基因 物不与失去lac操纵子全部基因 DNA分子结合 的DNA分子结合 在有IPTG时不与lac IPTG时不与lac操纵子基 在有IPTG时不与lac操纵子基 因结合 不与lacO 突变体的DNA DNA分子 不与lacOC突变体的DNA分子 结合 说明 I基因的产物有两个结合位点
※当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用； 当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用； 对该系统不能发挥作用 如无CAP加强转录，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合， CAP加强转录 ※如无CAP加强转录，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子 仍无转录活性。 仍无转录活性。 若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。 ※若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic 葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。 repression)。 ※ lac操纵子的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖 lac操纵子的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖
解离模型（直接作用）： ）：阻遏蛋白从操纵基因上解离 解离模型（直接作用）：阻遏蛋白从操纵基因上解离 下来的速率非常低（在缺乏诱导物时检测的结果） 下来的速率非常低（在缺乏诱导物时检测的结果）以 至不能和平衡模型相吻合。这就意味着诱导物必须在 至不能和平衡模型相吻合。 直接和结合在操纵基因上的阻遏蛋白相互作用。 直接和结合在操纵基因上的阻遏蛋白相互作用。可能 通过改变其构象使其离开操纵基因。 通过改变其构象使其离开操纵基因。
阻遏蛋白
β-半乳糖苷酶 半乳糖苷酶 别乳糖 有乳糖存在时 乳糖
诱导模式 平衡模型（间接作用）：DNA结合的阻遏蛋白和 平衡模型（间接作用）： ）： 结合的阻遏蛋白和 游离的阻遏蛋白迅速平衡，加入诱导物后， 游离的阻遏蛋白迅速平衡，加入诱导物后，诱导 物结合到游离的阻遏蛋白上，打破了平衡， 物结合到游离的阻遏蛋白上，打破了平衡，从而 导致结合的阻遏蛋白释放
Adenylate cyclase converts ATP into cAMP. Phosphodiesterase converts cAMP to AMP. Glucose catabolite may inhibit adenylate cyclase and stimulate Phosphodiesterase