细胞工程制药工艺技术基础

基本概念
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞， 大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40-50代，这种 传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状 态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养 条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。
细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具 有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。
动物细胞培养 基本概念 动物细胞大规模培养方法 动物细胞培养操作方式 动物细胞培养条件 动物细胞培养基的制备 动物细胞培养过程的检测与工艺基的制备
基本概念
动物细胞培养：就是从动物有机体中取出相关的组织， 将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中， 让这些细胞生长和增殖。 原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。 培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培 养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞 悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养， 称为传代培养。
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动物细胞培养条件
对培养条件要求严：动物无细胞壁保 护，细胞膜直接接触外界。对物理化学 因素耐受力很弱，容易受伤害。与细菌 和植物细胞相比，动物细胞培养条件要 求苛刻，周围环境十分敏感。
对培养基的要求高：需要容易利用、丰 富的相对低分子量的营养物，包括12种 必需氨基酸，8种以上维生素，多种无机 盐和微量元素，多种附加成分。能源： 单糖，葡萄糖，谷氨酰氨。氮源：氨基 酸单体化合物。
动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础
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常见生产用动物细胞系
人源细胞株系
Namalwa：从淋巴瘤病人中分离获得的类淋巴母细胞，非整体核型，2n=12～ 14，单X染色体，无Y染色体。表达IgM悬浮生长。外源基因的表达水平较高，可用 无血清培养基高密度培养。已成功地表达了rhEPO、rhG-CSF、tPA等，已用于大 规模生产干扰素，并批准上市。 WI-38:美国Wistar研究所从正常人胚肺组织分离获得的二倍体（ diploid）成
有SP2/O、J558L和NSO等。能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生
长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。
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常见生产用动物细胞系
昆虫细胞株系
Sf21：是从秋黏虫（Spodoptera frugiperda，fall armyworm)卵巢细胞中分离得到 的，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。
生物制药工艺学
Biopharmaceutical Technology
第五章 动物细胞工程制药技术
动物细胞工程主要应用技术 细胞培养 细胞融合
动物细胞工程是指按照人们预 定的设计，根据细胞生物学及 工程学原理定向改造动物细胞 遗传性的技术。
单克隆抗体
动物细胞工程
核 移 植
胚胎移植
动物细胞反应动力学、动物细胞反应器
动物细胞培养的基本过程
动物胚胎或幼龄动物的 组织、器官
胰蛋白酶 剪碎
单个细胞
制成 原 代 培 养
细胞悬 浮液
细 胞 贴 壁
细胞系 部分细胞“癌变”， 无限传代
细胞株
细胞
动物细胞培养不能 最终培养成动物体
50代细胞
剥离、分瓶 传代培养
10代细胞
实例
取动物器官 和组织
幼龄鼠
剪碎组织
Hale Waihona Puke Baidu胰蛋白酶处理
细胞培养 单个细胞
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合成培养基是用化学成分 明确的试剂配制的培养 基，组分稳定，可大量供 应。在动物细胞培养中最 常用培养基7－8种，如 BME、MEM、DMEM、 IMEM、M199等。合成培 养基中添加5％-10 ％的小牛血清。在杂交瘤 培养中，一般为10％～20 ％的胎牛血清。血清的加 入对培养非常有效，但对 培养产物的分离纯化和检 测会组成一定的不便。
纤维（fibroblast）细胞系，贴附型生长，2n=46。细胞倍增时间24小时，寿命50
代，第一个被用于制备疫苗。
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常见生产用动物细胞系
哺乳动物细胞株系
CHO细胞：从中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）中分离的上皮样 （epithelial）细胞系，贴附型生长体性，是目前使用最为普遍和成熟的宿主细胞。 属于贴壁生长细胞，可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白 质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。 BHK：从幼仓鼠的肾脏（baby hamster kidney, BHK）中分离的成纤维样细胞， 非整倍体，2n=44。用于增殖病毒，制备疫苗和重组蛋白。两种重组凝血因子Ⅷ， Bayer的Kogenate FS、Aventis Behring的Helixate分别于1989和1994被FDA获 准上市，1999年FDA批准Novo Nordisk的重组凝血因子VIIa（NovoSeven）上市， 用于治疗血友病。 杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，
血液中有四个缓冲体 系，碳酸盐、磷酸盐、 血红蛋白和血浆蛋白 缓冲体系。
渗透压
正常血浆渗 透压范围为 （690～ 859kPa）
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动物细胞培养基的制备
培养基
天然培养基是直接取自于动 物组织提取液或体液作 为培养基，如血浆凝块、血 清、淋巴液、胚胎浸出液 等。营养价值高，但成分复 杂，而且不稳定，来源也受 到限制，不宜大量培养和生 产使用。 血清是天然培养基中最有 效和最常用的培养基，来源 有胎牛血清、新生牛或成牛 血清、马血清、鸡血清、羊 血清及人血清，最广泛应用 的为胎牛血清和新生牛血 清。
Sf-9：是从秋黏虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，最常用的昆虫表达细胞。倍增时
间为18～24小时，能高效表达外源基因。 TN-5B1-4：是从粉纹夜蛾（Trichoplusia ni，TN）卵细胞匀浆中分离得到的，无血清 培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比SF9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。
温 度
哺乳动物细胞最 佳培养温度为 37℃，鸡细胞为 39℃～40℃，而 昆虫类细胞为 25℃～28℃。
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氧 气
离体培养的气 体含有5％CO2 和95％空气， 其中氧浓度为 21％。有时充 以N2气稀释O2 浓度。
pH值
绝大多数低于 6.8或超过7.6会 对细胞产生严重 影响动物细胞， 甚至使细胞死亡。