琼脂糖凝胶电泳常见问题

琼脂糖凝胶电泳常见问题解答核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。

琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。

琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。

但操作过程中仍有不少要注意的问题。

1 凝胶制作1．1 凝胶浓度配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在0．8％～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。

粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。

以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。

核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g ／ml；也可在电泳结束后染色。

1、2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。

梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。

另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。

当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。

琼脂糖凝胶电泳及其影响因素琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。

该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。

当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。

琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。

琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。

聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。

聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。

目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。

在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、 DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。

DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。

凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。

分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3、 DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。

Marker参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。

新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。

也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解：DNA带模糊??：1、DNA降解??避免核酸酶污染。

2、DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。

3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

4、DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。

6、DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。

好象没跑出来，是怎么回事？参考见解：1、根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。

2、紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。

3、最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。

4、电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。

怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？参考见解：1、跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。

因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。

2、在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。

琼脂糖电泳是一种常用的核酸和蛋白质分离和纯化方法。

通过利用琼脂糖的凝胶特性，将待测样品分子按照大小和电荷进行分离。

在琼脂糖电泳实验中，电压和电流的设置对实验结果有着重要的影响。

下面我将详细介绍琼脂糖电泳电压和电流的设置方法和注意事项。

一、电压的设置1. 琼脂糖电泳实验中，电压的设置应根据待测分子的大小来确定。

较小的DNA片段通常需要较高的电压，而较大的DNA片段则需要较低的电压。

2. 选择合适的电压可以提高分离速度和分辨率。

但是过高的电压会导致琼脂糖凝胶发热、溶胶蒸发和样品失去活性等问题，因此需要谨慎设置。

3. 一般情况下，琼脂糖电泳实验的电压范围为50-150V。

如果待测分子较小，可以选择较高的电压，最大不超过150V。

大片段DNA则应选择较低的电压，最小不低于50V。

二、电流的设置1. 电流是根据电压和电阻来计算得到的，它与琼脂糖凝胶中的离子浓度和凝胶孔隙大小有关。

凝胶浓度越高，孔隙越小，电流就越小。

2. 电流的设置应根据实验室所使用的琼脂糖凝胶和电泳槽的尺寸来确定。

一般情况下，电流范围为10-30mA。

3. 在设置电流时，需要根据具体实验条件进行调整。

如果电流过高，可能会导致凝胶加热、样品失活等问题；而电流过低，则可能导致分离速度缓慢、分辨率下降等。

三、注意事项1. 在进行琼脂糖电泳实验前，要仔细检查电泳槽、电极和电源等设备是否正常工作，以确保实验的顺利进行。

2. 在设置电压和电流之前，需要根据待测样品的大小、琼脂糖凝胶的浓度和孔隙大小等因素进行综合考虑，并进行初步的试验和优化。

3. 在实验过程中，要定期检查电泳槽内的温度和电压情况，确保实验的稳定性和可靠性。

4. 对于不同的琼脂糖电泳实验，根据实际需要可以进行不同的电压和电流设置，以获得最佳的分离效果。

总结起来，琼脂糖电泳电压和电流的设置应根据待测分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度和孔隙大小等因素进行综合考虑。

合理的电压和电流设置可以提高实验的分离速度和分辨率，同时还需要注意避免电泳槽发热、溶胶蒸发和样品失活等问题。

琼脂糖凝胶电泳常见问题
缓冲液稀释DNA出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。

减少dNTP 的浓度。

适当降低 Mg2+浓度。

增加模板量，减少循环次数。

不规则DNA带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换DNA变性电泳前勿加热，用20mM Nacl 缓冲液稀释DNA带弱或无DNA带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低DNA降解实验过程避免核酸酶污染DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源DNA带缺失DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度DNA变性电泳前勿加热，用20mM Nacl 缓冲液稀释DNADNA链巨大，常规凝胶电泳不合适在脉冲凝胶电泳上分析电泳时Ladder扭曲配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可电泳时电压过高电泳时电压不应超过20V/CM
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mirna琼脂糖凝胶电泳注意事项引言：mirna琼脂糖凝胶电泳是一种常用的实验方法，用于分离和检测小分子核酸mirna。

在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验时，需要注意一些事项，以确保实验的准确性和可靠性。

本文将介绍mirna琼脂糖凝胶电泳的注意事项。

一、实验准备在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验之前，首先需要准备实验所需的试剂和仪器设备。

确保琼脂糖、电泳缓冲液、样品等试剂的质量良好，并按照实验方案准备好所需的浓度和体积。

二、样品处理在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验之前，需要对样品进行处理。

首先，需要从细胞或组织中提取mirna，并纯化得到纯净的mirna样品。

其次，需要对mirna样品进行定量，以确保加载合适的样品量。

三、样品加载样品加载是mirna琼脂糖凝胶电泳实验中的关键步骤。

在加载样品之前，需要根据实验设计合理地安排样品的顺序，以便于结果的分析和解读。

此外，需要在电泳缓冲液中加入适量的载体RNA，以增加样品的稳定性和可视性。

四、电泳条件在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验时，需要注意电泳条件的选择。

首先，需要选择合适的电泳缓冲液和电泳温度，以确保样品在电泳过程中能够得到充分的分离。

其次，需要根据样品的大小和预期的分离效果，选择适当的电压和电泳时间。

五、染色和可视化实验完成后，需要对琼脂糖凝胶进行染色和可视化。

常用的染色方法有溴化乙锭染色和银染色。

选择合适的染色方法，并按照说明书的要求进行染色操作。

染色完成后，需要使用适当的仪器设备进行凝胶图像的拍摄和分析。

六、结果分析mirna琼脂糖凝胶电泳实验得到的结果需要进行准确的分析和解读。

首先，需要根据实验设计和样品加载的顺序，确定gel中mirna的迁移方向。

其次，需要根据样品的大小和迁移距离，判断mirna的相对表达水平。

最后，需要将实验结果与其他实验数据进行比较和分析，以获得更准确的结论。

七、实验记录和保存在进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验时，需要及时记录实验过程和结果。

琼脂糖凝胶电泳常见问题分析DNA凝胶电泳简介一、实验原理DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。

根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。

2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。

电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。

由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。

二、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。

琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。

表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。

表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。

随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。

（5）其它类型。

各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。

琼脂糖凝胶电泳及其影响因素琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。

该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。

当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。

琼脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各种形状、大小和孔隙度。

琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。

琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。

聚丙烯酰胺分离小片段DNA(5-500bp)效果较好,其分辩力极高,甚至相差1bp的DNA片段就能分开。

聚丙烯酰胺凝胶电泳很快,可容纳相对大量的DNA,但制备和操作比琼脂糖凝胶困难。

聚丙烯酰胺凝胶采用垂直装置进行电泳。

目前,一般实验室多用琼脂糖水平平板凝胶电泳装置进行DNA电泳。

琼脂糖主要在DNA制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。

在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、 DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。

2、琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。

DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。

凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。

分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%,DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。

3、 DNA分子的构象当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。

mirna琼脂糖凝胶电泳注意事项
进行mirna琼脂糖凝胶电泳实验时，需要注意以下事项：
1. 准备样品：将样品提取并纯化，保证样品的质量和纯度。

2. 准备琼脂糖凝胶：根据实验需要选择合适的琼脂糖浓度和凝胶百分比，并根据凝胶大小决定所需的凝胶缓冲液量。

3. 加载样品：将样品与加载缓冲液混合，并将混合物小心地加入琼脂糖凝胶槽中。

注意不要产生气泡。

4. 设置电泳条件：根据实验需要设置合适的电流、电压和电泳时间。

适当的条件可以获得更好的电泳结果。

5. 预处理凝胶：在电泳之前，将凝胶浸泡在凝胶缓冲液中预处理一段时间，以确保凝胶与缓冲液充分交换。

6. 安全使用电源：在使用电源之前，确保电源连接正确，并按照安全操作规程操作，以避免电击或火灾等意外。

7. 注意数据分析：电泳完成后，将凝胶拍照或进行图像扫描，并进行数据分析。

确保准确测量和比较样品之间的迁移距离和强度。

8. 实验后处理：实验结束后，处理琼脂糖凝胶和化学品废弃物时，要按照相关的安全规定和环保要求进行处理。

琼脂糖凝胶电泳失败的三大原因及解决方法琼脂糖凝胶电泳是常用分离DNA或RNA等生物大分子的方法之一。

但是，在进行琼脂糖凝胶电泳时，经常会出现失败的情况，影响实验
结果。

下面介绍三种常见的琼脂糖凝胶电泳失败原因及解决方法。

一、凝胶制备不当
凝胶制备不当是琼脂糖凝胶电泳失败的常见原因之一。

凝胶的浓
度和 pH 值的不准确，会导致样品在凝胶上的迁移速度不同，分离效
果差。

解决方法：
1、准确称量琼脂糖的用量，按标准比例配制凝胶；
2、保持 pH 值适当，通常为 7.5-8.0；
3、使用新鲜的试剂，防止污染。

二、电泳条件不正确
电泳条件对于琼脂糖凝胶电泳的成功与否有很大的影响，如果电
泳时间不够或者电场强度不够，样品可能没有分离开来。

解决方法：
1、选择正确的电泳缓冲液；
2、根据样品的大小和特性来制定合适的电泳时间和电场强度；
3、定期更换电泳缓冲液，防止污染。

三、样品制备不当
样品制备不良，也是琼脂糖凝胶电泳失败的原因之一。

不同的组织、细胞、DNA或RNA等样品，对样品的制备条件有不同的要求。

解决方法：
1、严格按照标准或常规操作制备样品；
2、根据样品的大小和性质，选择合适的溶解方法；
3、尽可能地去除污染物或者其他干扰物。

综上所述，准备好琼脂糖凝胶，选择合适的电泳条件，以及正确地制备样品，是避免琼脂糖凝胶电泳失败的关键。

琼脂糖凝胶电泳实验注意事项琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的方法。

它可以根据生物大分子的大小和电荷来进行分离，因此在生命科学研究中得到广泛应用。

在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们需要注意以下几个方面。

实验前准备工作非常重要。

在进行琼脂糖凝胶电泳实验之前，要确保实验室的设备和试剂都已经准备好。

这包括琼脂糖凝胶、试样缓冲液、DNA标记物、电泳槽、电源等。

同时，还需要检查电泳槽和电源是否正常工作，以确保实验的顺利进行。

要注意琼脂糖凝胶的制备。

制备琼脂糖凝胶时，需要按照一定的比例将琼脂糖溶解在缓冲液中，并加热搅拌使其完全溶解。

然后，将溶液倒入电泳槽中，并在上部加入一定量的甲醛，使其固化。

在制备琼脂糖凝胶的过程中，要注意控制好溶液的温度和搅拌的速度，以保证琼脂糖凝胶的质量。

样品的处理也非常重要。

在进行琼脂糖凝胶电泳实验之前，需要对样品进行处理。

对于DNA分析实验，可以将DNA样品进行酶切、PCR扩增等处理，以获取所需的DNA片段。

而对于蛋白质分析实验，可以对蛋白质进行纯化、浓缩等处理，以提高实验的准确性和灵敏度。

在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，还需要注意电泳条件的选择。

电泳条件包括电压、电泳时间和缓冲液的选择等。

一般来说，较低的电压和较长的电泳时间可以得到更好的分离效果，但同时也会延长实验的时间。

而缓冲液的选择则根据实验的需求来确定，常用的缓冲液有TAE缓冲液和TBE缓冲液等。

要注意实验过程中的安全问题。

在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，要注意避免接触到电泳缓冲液和染料等有害物质。

同时，还要注意电源和电泳槽的安全使用，避免发生短路和漏电等情况。

在实验结束后要进行结果的分析和解读。

根据琼脂糖凝胶电泳的结果，可以判断样品中的生物大分子的大小和电荷。

通过与标准品的比较，可以进一步确定样品中的生物大分子的特性和浓度等信息。

琼脂糖凝胶电泳是一种重要的生物分析技术，在进行实验时需要注意实验前的准备工作、琼脂糖凝胶的制备、样品的处理、电泳条件的选择、实验过程中的安全问题以及结果的分析和解读。

1.DNA片段分离不良：DNA分离不良的最常见的原因是琼脂糖浓度选择不当。

应该用低浓度的琼脂糖凝胶来分离相对分子质量高的DNA片段，而用高浓度的凝胶分离相对分子质量低的DNA。

条带模糊在分离小的DNA片段时，尤其常见。

这是由于DNA通过凝胶时发生弥散。

当用低电压长时间凝胶电泳时特别容易出现。

2.条带涂布：在分离相对分子质量高的DNA片段时，最常发生DNA条带的拖带和涂布。

最常见的原因是DNA样本过量，或电泳的电压过高。

DNA样本被点到撕裂的点样孔中也会引起广泛的涂布，因为DNA容易在琼脂糖与凝胶支持物之间迁移。

3.凝胶融化：电泳分离时琼脂糖凝胶融化表明，在制备凝胶时没有用电泳缓冲液，或者在电泳过程中电泳缓冲液耗尽。

在用高电压长时间电泳时，应该用TBE而不是TAE，因为TBE的缓冲能力更强。

而且，微型凝胶和中型凝胶槽只能装少量的缓冲液，比较大的凝胶槽更容易耗竭缓冲液。

琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解： DNA带模糊??：1、 DNA降解??避免核酸酶污染。

2、 DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。

3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。

4、 DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。

5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。

6、 DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。

好象没跑出来，是怎么回事？参考见解：1、根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。

2、紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。

琼脂糖凝胶电泳常见问题分析DNA凝胶电泳简介一、实验原理DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。

根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。

2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。

电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。

由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。

二、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。

琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。

表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。

表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。

随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。

（5）其它类型。

各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。

三、DNA电泳影响因素DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。

实验三琼脂糖凝胶电泳一、实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术。

把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。

由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基，因此在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应。

具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。

凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，而构型不同的DNA分子。

在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。

相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。

在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB)，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA 进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段。

本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法。

二、仪器及试剂1.仪器及耗材：水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、微波炉、微量移液器、透明胶带、点样板或parafilm、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、吸头等。

2.试剂及配制：50×TAE缓冲液的配制：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA（pH8.0）配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解，将溶液定容至1 L后。

高温高压灭菌，室温保存。

DNA琼脂糖凝胶电泳一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。

F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。

由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。

此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。

当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。

根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。

该公式指球形颗粒所受的阻力。

代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。

带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。

在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。

它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。

影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。

二、琼脂糖凝胶电泳通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。

用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。

这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。

此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。

一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。

不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。

具体见表格：琼脂糖凝胶 /% m/V 分离线性DNA片段的范围 /kb0.3 50---600.6 1----200.7 0.8---100.9 0.5---7.01.2 0.4----6.01.5 0.3---3.02.0 0.1---2.0琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液：缓冲液pH1.50mmol/L Tris-NaH2PO4-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.02.50mmol/L NaH2PO4- Na2HPO4-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.03.50mmol/L Tris-乙酸-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.04.50mmol/L 乙酸钠-乙酸-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.033琼脂糖凝胶电泳常用的样品缓冲液(示踪染料)：0.25%溴酚蓝-0.25%二甲苯青FF-30%甘油水溶液，并且这两种指示剂在琼脂糖凝胶中的迁移率不同，可以指示一定片段长度的DNA迁移率(具体见下表)。

琼脂糖凝胶电泳条带波浪形
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的生物分子分离技术，可以将不同大小、电荷和形态的生物分子在电场作用下沿着凝胶带电移动，从而实现分离。

在实验中，常常会出现琼脂糖凝胶电泳条带呈现波浪形的现象。

这种波浪形条带在分析DNA或RNA等分子时，常常会影响分析结果的可靠性。

波浪形条带的形成原因可能有多种，其中最常见的是凝胶电泳中的电场不均匀和凝胶浓度不均匀。

在实验中，如果凝胶浓度不够均匀，导致凝胶密度不均匀，电场会在凝胶中产生不同的电位梯度，从而导致分离速度不同，形成波浪形条带。

此外，如果电泳槽中的电场不均匀，同样会导致波浪形条带的出现。

在使用琼脂糖凝胶电泳进行生物分子分析时，应该尽可能保证凝胶浓度均匀，电场均匀，以避免波浪形条带的干扰。

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琼脂糖凝胶电泳加样的注意事项
DNA分子带负电，从琼脂糖凝胶的负极向正极泳动，速度依赖于其分子质量。

小的紧密的DＮA分子的较大伸展片断容易穿过琼脂糖介质。

依据所要分离的DNＡ分子的大小来选择琼脂糖的浓度，例如质量浓度3mｇ／ml的琼脂糖用来做DNA大片段电泳(＞2000０碱基）而0.8%只能电泳小的片断。

要注意以下几点:
１、用移液抢将样品加至点样孔。

每孔点样的体积一般少于２5ul,因此吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。

2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度，以使每个样品停留在各自的点样孔中。

３、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料（如溴酚蓝）,用以看出样品移动的距离。

4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品,电泳结束后,根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线。

5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。

注意电泳期间,电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发,又可以降低电击的可能性。

6、电泳结束后，将胶浸没在１mｇ／L的溴化乙锭(EB）中，5ｍiｎ后即可看到DＮＡ带，EB通过插入在双螺旋的配对核苷酸之间同NＤA结合。

另一种方法是电泳时,在胶中加入ＥB。

７、在紫外灯下,由于EB发出强烈的橘红色的荧光,所以可以看到ＤNA带。

利用这种方法检测的界限是每条带约10ng ＤＮA。

带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害。

可用尺子来测量每条带至点样孔的距离。

同样，利用特制的照相机和调焦器,也可以对凝胶拍照。

8、如果要对某一条带(如质粒)进一步分析，可用小刀将含该带的凝胶切割下来,从带中回收DＮA。