生物医学亲和层析相互作用
1概述
亲和层析属于液相色谱,它是以共价偶联了亲和配体的介质为固定相来吸附或研究与其发生相互作用的分子。亲和配体可以是蛋白分子、酶、抗体、抗原,也可以是一段DNA或RNA序列、仿生染料、酶的底物或抑制剂、小分子化合物(如药物或激素)等。很多亲和配体具有很高的选择性,将偶联了配体的介质装在柱子中,可以很好的用于分离、检测或研究复杂样品中的目标分子。亲和层析介质主要由三部分组成:配体、间隔壁、基质。配体是决定亲和层析成功与否的一个重要因素。根据配体的类型,可以将亲和层析进行分类,如凝集素亲和层析、硼酸盐亲和层析、免疫亲和层析、金属螯合亲和层析等。在设计和使用亲和层析柱时,偶联配体所使用的基质的类型也很重要。以琼脂糖或纤维素等多糖类物质为基质的亲和层析介质常用于样品预处理或者靶分子的分离纯化。这种基质易于修饰和活化,有利于基质和配体的偶联,并且具有较好的物理化学稳定性,非特异性吸附少。但是这种基质的机械性能较差,在使用时柱压不能太高,分辨率和效率相对于高压系统也较低。对于高压液相亲和层析,可以使用二氧化硅颗粒或者整体柱材料为基质。采用这种基质的亲和层析柱可以用于HPLC或与其他分析方法(如质谱)联合运用。
2亲和层析应用的常见方式
首先,要选择合适的样品处理缓冲液以利于目标分子与配体的结合。将处理好的样品上到亲和层析柱上,与配体无相互作用或作用弱的分子从柱子上穿出;然后通过更改流动相的pH或添加竞争剂,使目标分子与配体解离从而被洗脱下来。根据目标分子的性质,可以通过紫外吸收、荧光、质谱等方法对其进行检测。亲和层析的分离过程简单、快速,具有较高的选择性,广泛用于生物医学和药物分析中样品的分离和预处理。另外,除了可以利用亲和层析的吸附作用来富集目标分子外,同样也可以利用亲和层析来去除样品中影响分析的分子。如在蛋白组学的研究中,可以用亲和层析柱先去除白蛋白、IgG等高丰度蛋白,再研究低丰度蛋白。
3凝集素亲和层析
凝集素是一种非免疫来源的蛋白质,能识别并结合特定类型的糖基,广泛分布于植物、动物和微生物中。凝集素亲和层析以偶联了凝集素的基质为固定相,常用的凝集素有伴刀豆凝集素A(ConA)、麦胚凝集素(WGA)、榴莲凝素等,它
们能识别不同的糖基,广泛用于分离和鉴定糖蛋白、糖肽、糖脂、寡糖。
4硼酸盐亲和层析
硼酸盐亲和层析以硼酸盐为配体。在碱性条件下,大多数硼酸盐衍生物能与含顺式二醇基团的糖或糖蛋白结合。在过去的几十年中,临床实验室一直将其用于糖化血红蛋白的定量。糖化白蛋白以及一些载脂蛋白也可以用类似的方法来分析研究。等利用“点击化学”(clickchemistry)的方法合成了新的硼酸盐,可以用于分离糖蛋白如卵清蛋白和RNaseB。将硼酸盐和凝集素共同偶联到基质上,可以更好的用于分离糖蛋白。
5免疫亲和层析
免疫亲和层析是利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和力进行分离的方法。以抗体为配体,免疫亲和层析可以用于分离纯化激素、酶、多肽、病毒等。在临床实验室,该方法已经被用于分析乙酰胆碱酯酶、联苯胺、IgG、胰岛素、转铁蛋白等。以抗原或蛋白A/G为配体,可以对抗体进行纯化。
6金属螯合亲和层析
金属螯合亲和层析是利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和基质上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化。金属离子通过螯合剂固定在基质上,常用的离子有Ni2+、Zn2+、Cu2+、Fe3+等,它们与氨基酸残基的结合能力有强有弱。金属螯合亲和层析可以用于药物检测前的样品预处理,还可以结合质谱用于疾病诊断标志物的检测。
7生物分子相互作用研究
亲和层析除了可以用于分离和测定靶分子,还可以用于研究生物分子的相互作用,如酶/抑制剂、蛋白/蛋白、蛋白/DNA等[11]。GSTpulldown就是一种研究蛋白相互作用的技术,其基本流程是:将“诱饵”蛋白与GST融合表达,当融合蛋白通过偶联了GSH的柱子时,可以通过GSH和GST的亲和作用而吸附在柱子上,把待测样品上到柱子上,与诱饵蛋白相互作用的蛋白就会被吸附到柱子上,再对其分析鉴定即可[12]。在生物医学和药物分析研究中,亲和层析已经成为一项常规的分离工具。通过使用不同的配体和基质,并结合其他技术和方法,来达到所需的应用目的。另外,亲和层析还可以用于研究生物分子的相互作用等,相信未来亲和层析的应用会越来越广泛。
