免疫组化步骤

免疫组化实验步骤流程1.样品制备：a.组织样品：从动物或人体获得的组织样品首先需要固定在福尔马林中，然后通过蜡包埋技术将组织固定在蜡块中。

之后，将蜡块切成薄片，然后将薄片分别放置于载玻片上。

b.细胞样品：将细胞悬浮液放置在载玻片上，并用福尔马林进行固定。

2.抗原恢复：固定的组织或细胞样品经过脱水和脱脂处理后，需要通过抗原恢复来揭示隐藏的抗原。

抗原恢复的方法可以是热处理、酶切或化学处理等。

3.形成蛋白结合位点：将载玻片上的样品用蛋白结合剂如牛血清白蛋白（BSA）、鱼胶或生物素素蛋白结合剂等进行封闭处理，以防止非特异性结合。

4.孵育抗体：a.主抗体：将特异性的首要抗体加入到样品中，与目标抗原结合形成抗原抗体复合物。

b.辅助抗体：添加荧光素或酶标记的次抗体，与主抗体结合，以扩大信号的产生。

5.洗涤：用缓冲液洗涤载玻片，以去除未结合的抗体和其他无关物质。

6.信号增强：a.酶标记的实验，为了增加信号强度，可以加入荧光素或发光底物。

b.荧光标记的实验，可以直接观察荧光。

7.显色：在酶标记的实验中，加入染色底物以产生可见的颜色，从而定位并显示目标抗原的存在。

8.盖玻片：在涂抹适当封片剂后，将载玻片盖上一片封片玻片，以保护样品并减少光的干扰。

9.显微镜观察：使用显微镜观察载玻片下的样品，并通过图像系统进行图像捕捉和分析。

10.结果评估：评估图像和数据以确定抗原的表达和分布情况。

根据实验目的，可以进行半定量或定量的数据分析。

需要注意的是，免疫组化实验中的条件、试剂和步骤会因实验目的不同而略有差异。

因此，在进行实验前需仔细阅读相关文献和制定适合的实验方案，以确保实验结果的准确性和可靠性。

免疫组化操作方法一、脱蜡1. 将组织切片至于玻片加上，65°C烘箱烘烤2-4小时，是石蜡完全熔融。

2. 将烘烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第三缸二甲苯中，浸泡10min。

3. 从二甲苯中取出切片，尽量沥干二甲苯，置入无水乙醇中，浸泡3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；取出切片，再依次置入90%、80%、70%酒精中梯度水化，各浸泡3min。

（切片脱蜡复水目前仪器自动完成）4.，PBS冲洗2-3次，每次3-5min，3% H2O2室温孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

二、抗原修复（以EDTA(PH 8.0/9.0)为例，常用的还有枸橼酸)1. 用流水冲洗切片1-2min，洗净切片表面的酒精；取出切片，用蒸馏水润洗切片表面2-3次，每次3-5min。

2. 将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的EDTA中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min。

（实际操作：微波炉高火8min*2）3. 取出修复盒，使其自然冷却至室温。

三、封闭1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的EDTA 3次，每次3min。

2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。

3. 将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。

4. 将切片置于湿盒上，滴加5%的BSA，37°C培养箱孵育30-40min（或4°C冰箱孵育过夜）。

四、一抗孵育1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的BSA 3次，每次3min。

2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。

（大多数时候步骤1. 2 不做，可直接擦拭干净BSA 滴加稀释好的一抗）3. 按照一定的稀释比例，用抗体稀释液稀释抗体。

免疫组化主要步骤1. 洗载玻片:将载玻片置于重铬酸钾和浓H2SO4混合液中,目的是为了是载玻片上的硅胶等除去,同时使一些肉眼看不见的凹凸不平的表面变平整,便于组织吸附,然后置于清水中清洗,除去残余的重铬酸钾和浓H2SO4(大约冲一个小时左右),再将载玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37°C温箱中，将多聚赖氨酸涂布于玻片的表面，由于Lys带正电，而大多数的组织带负电荷，从而产生吸附作用。

2. 包埋组织:先在铁模具中加入一些液态石蜡，先稍微冷却，然后再将待包埋的组织置于石蜡之中，并排列整齐，再将塑料模具盒盖上，最后加入少许液体石蜡，进行冷冻，使石蜡变成固态。

3. 切片：将包埋好的组织从模具上取下来，并置于石蜡切片机上，切片机通过调节上下左右来来使组织和切割方向一致，然后调节切片的厚度，一般为5µm,如果比较难切，则可以适当调整厚度，用毛笔将切割的载玻片向外拉，并用小镊子将包含有完整组织的载玻片置于40°C温水中。

4. 捞组织：当组织载玻片置于40°C温水中之前，要先将水浴中的气泡赶走，以免气泡受热上浮而贴到组织上，组织受热展开，最好是组织不起皱纹，用载玻片捞组织时，一般取载玻片的下1/3或者下1/2一般每种组织捞5-6张，其中2-3张是备用的，每张载玻片上通常捞两份组织，做对照使用，这样形成的误差就比较小了，而且捞载玻片的时候最好方向一致，以便观察，再将捞出来的载玻片置于架子上，放入37°C温箱中烘干。

5. 脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.6. 抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。

免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。

免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。

下面是免疫组化的操作流程。

1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。

样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。

对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。

2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。

为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。

常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。

3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。

抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。

这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。

4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。

一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。

待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。

5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。

洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。

6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。

二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。

这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。

7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。

8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。

最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。

其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。

9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。

可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。

总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。

免疫组化法实验操作步骤以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：1.样本准备：a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。

b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。

c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。

2.制备切片：a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。

b.将切片平均分配在载玻片上。

3.制备蜡块：a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。

b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。

c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。

4.抗原恢复：a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。

b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。

c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。

5.抗体处理：a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。

b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。

c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。

d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。

6.清洗：a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。

b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。

7.检测标记：a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。

b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。

8.染色：a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。

b.若使用荧光标记物，则观察荧光信号。

9.显微镜观察：a.使用适当的显微镜观察切片，记录和分析结果。

b.对于荧光标记，可以使用特定的荧光染色剂如DAPI进行细胞核染色。

10.结果分析：a.根据实验设计和目的，对结果进行定性或定量分析。

b.可以使用图像分析软件进行影像处理和数据分析。

免疫组化步骤和注意事项免疫组化是一种重要的实验技术，用于鉴定细胞、组织或生物样本中特定抗原的分布和表达情况。

它可以通过对特定抗原与抗体的特异性结合来检测目标分子的存在和定位。

下面将介绍免疫组化的步骤和注意事项。

免疫组化的主要步骤包括抗原脱蜡、抗体反应、显色和染色。

1. 抗原脱蜡：免疫组化的第一步是将组织样本或细胞脱脂、脱蜡和重水化，以去除蜡质，并使抗体更容易与目标抗原反应。

2. 抗体反应：将脱蜡的组织样本或细胞块通过抗原修复处理，以恢复抗原的免疫反应性。

然后，将免疫抗体与待检测的抗原反应，形成免疫复合物。

免疫抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以与组织或细胞中的特定抗原高度特异性地结合。

3. 显色：免疫复合物形成后，可以使用标记有酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记的二抗来检测免疫复合物。

在酶法中，可添加草酰胺基苯酸（DAB）或硫代硝基羟基苯并啶（NBT/BCIP）等底物以产生可见的色素沉积。

在荧光法中，免疫复合物被激光器或荧光灯激发后，会发出特定颜色的荧光信号。

4. 染色：完成显色后，可以通过核染色（如用伊红、伊红和伊蓝）来观察细胞核的形态特征，以配合免疫标记物的定位。

虽然免疫组化是一种有价值的技术，但在实施过程中也需要注意一些问题：1. 选择合适的抗体：在进行免疫组化实验时，选择特异性高、效价好的一抗抗体非常重要。

一抗抗体的选择应基于抗原的特异性和病变的病理生理特性。

2. 优化抗体浓度：免疫组化实验中，抗体浓度的选择是关键因素。

过高的抗体浓度会导致非特异性的染色，而过低的浓度则无法检测到目标抗原。

3. 优化抗原修复处理：抗原修复处理对于免疫组化的成功非常重要。

选择合适的抗原修复方法可以增强组织或细胞中的抗原的免疫反应性。

4. 阴性对照和阳性对照：为了验证实验的可靠性，每次免疫组化实验都应包括阴性对照和阳性对照。

阴性对照不包含待检测的抗原，而阳性对照则确保抗体和显色试剂的正常工作。

5. 切片质量：免疫组化实验的结果直接受到切片质量的影响。

免疫组化相关步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原抗体反应的方法，用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。

下面将详细介绍免疫组化的相关步骤。

免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反应和染色，具体如下：1.样品制备：首先，需要获取组织标本。

通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片等方法制备标本。

制备好的标本需要保持完整和有代表性，通常要求切片不超过5μm厚。

2.抗原修复：组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性，因此需要进行抗原修复，以恢复抗原的表达。

常用的抗原修复方法包括热解修复（如加热、压力煮等）和酶解修复（如胰蛋白酶消化等）。

3.阻断：组织切片会与非特异抗体结合，影响免疫反应的特异性，因此需要进行阻断。

常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉进行阻断，以防止非特异性背景信号的产生。

4.一抗反应：将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上，使其与目标抗原结合。

特异性抗体可针对不同的抗原进行选择，如研究一些蛋白质的表达，可以选择该蛋白的特异性抗体。

5.二抗反应：一抗与抗原结合后，需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。

二抗通常是免疫出来的，其与一抗结合后，可形成复合物，具有荧光或酶标记。

6.染色：最后，通过染色方法来显示抗原的表达。

染色可以是荧光染色或酶标染色。

荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记，并在荧光显微镜下观察。

酶标染色则使用酶标记的二抗，再加入相应的底物进行染色。

除了以上的基本步骤1.控制组：为了验证实验是否准确，通常需要设置阴性和阳性对照组。

阴性对照组通常是替代一抗的种属、浓度和机制抗体；阳性对照组是已知具有目标蛋白表达的组织切片。

2.负载密度和反应时间：一抗的负载密度和反应时间需要优化，以确保对目标蛋白的增强标识，同时最大限度地减少背景信号。

3.显微镜观察和图像分析：观察染色结果时，要选择合适的显微镜，以获得清晰的图像。

免疫组化步骤取组织、固定、制片（脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70%酒精20min 80%酒精1h90%酒精1h 95%酒精Ⅰ2h95%酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1:1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡：石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸（不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3%的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液，每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺），室温孵育2~10分钟，显微镜观察十三、苏木精复染：苏木精复染5min，水洗3min，0.1%HCl浸提两次，水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明：70%酒精3min、80%酒精3min、90%酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。

免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。

2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。

步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。

2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。

3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。

步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。

2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。

步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。

抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。

2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。

孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。

步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。

2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。

步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。

2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。

步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。

常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。

2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。

步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。

2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。

步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。

2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。

这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。

免疫组化超详细步骤免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。

下面是免疫组化的详细步骤：1.样本准备：a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。

b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。

c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。

2.抗原的暴露：a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。

b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。

3.抗原检测步骤：a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。

常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。

b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。

4.抗体标记检测：a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，与样本中的特定抗原结合。

b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样本中，与一抗结合。

二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。

5.洗涤：a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。

6.反应可视化：a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到标记物的信号。

b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。

7.整理和分析：a.包装：用透明性的封片将样本封装，以便保存并观察。

b.分析：使用显微镜分析样本的结果，例如观察染色的细胞或组织的形态、信号定位等。

免疫组化基本步骤免疫组化是一种研究细胞或组织中特定抗原表达的方法。

它是通过将已知抗原与未知组织或细胞的衍生物进行反应，然后通过可见光或荧光显微镜观察这些抗原的表达情况。

免疫组化的基本步骤如下：1.样本预处理：首先，需要对待检组织样本进行预处理。

这通常包括固定和包埋。

固定可以使用甲醛、乙醇等化学物质进行，目的是保持组织或细胞的形态结构和细胞膜完整性。

接下来，样本通常会被包埋在石蜡或冰冻剂中，以便进行切片。

2.切片制备：将处理后的样本切片。

通常可以使用切片机或超薄切片机将固定好的组织切成薄片，通常为4-10微米。

切片可以更好地展示组织结构和细胞的形态。

3.抗原恢复：根据需要，可能需要进行抗原恢复步骤。

抗原恢复是通过热或酶解的方法，来使抗原的免疫原性恢复。

这是因为在组织固定的过程中，抗原常常会被交联变性，丧失免疫反应性。

4.抗体染色：将待检样本与已知抗体进行反应。

已知抗体可以是单克隆或多克隆抗体。

这些抗体具有对特定抗原的亲和力。

反应通常在生物素-链霉亲和素体系或酶-抗酶（如辣根过氧化物酶）体系中进行。

通过这些反应，待检抗原会与抗体结合，形成抗原和抗体的复合物。

5.检测标记物：接下来，需要对已形成的抗原-抗体复合物进行检测。

这通常涉及到糖基化酶物质（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记抗体。

检测标记物的选择取决于研究者的需求以及所使用的设备和系统。

6.显色：根据使用的检测标记物不同，需要进行相应的显色步骤。

对于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶体系，可以使用底物通过化学反应产生颜色信号。

对于荧光标记抗体，可以通过激光或紫外线照射来使其发出荧光光。

7.显微观察：将显色后的样本放置在显微镜下进行观察。

根据待检抗原的位置和表达情况，可以通过显微镜来观察和分析组织或细胞中抗原的分布和表达水平。

免疫组化技术在医学研究和临床诊断中发挥着重要的作用。

它能够帮助研究人员了解组织或细胞中特定抗原的表达情况，从而深入了解疾病的发生机制，并且可以用于辅助诊断和病理分析。

免疫组化操作步骤一免疫组化（LP法）操作步骤：1.切片常规脱蜡至水。

如需抗原修复，可在此步后进行2.缓冲液洗3min/2次。

3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育10-15 分钟。

4.缓冲液洗5min/2次。

5.滴加Ultra V Block ,在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。

（注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。

如果一抗的稀释液中含有5 一10%正常羊血活，这一步可以省略。

）6.缓冲液洗5min/2次。

7.滴加一抗工作液37 C孵育1 — 2小时。

（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8.缓冲液洗5min/2次。

9. 滴加Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育20分钟。

10.缓冲液洗5min/2 次。

11.滴加HRP Polymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。

（注：HRP Polymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。

）12.缓冲液洗5min/2 次。

13.向1ml DABPlus Substrate （或 AEC Plus Substrate）中滴加1-2 滴DAB Plus Chromogen （或AEC Plus Chromogen ）,混匀后滴加到切片上，孵育 3 — 15 分钟。

（具体时间由染色深浅决定。

）14.自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。

二.免疫组化（三步法）操作步骤：（1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（2 ）、3%H 2 O 2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（3 ）、蒸僻水冲洗，PBS浸泡5分钟x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

（4 ）、5-10%正常山羊血活（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血活，勿洗。

滴加一抗工作液，37 C孵育1-2小时或4 C过夜。

（5 ）、PBS冲洗，5分钟x3次。

免疫组化实验步骤1）编号NB（神经母细胞瘤）、T（实体瘤）。

2）烘片，60℃，30min。

3）标记染色蛋白，即标明目的蛋白4）脱蜡至水。

第一缸二甲苯代替物10min，第二缸二甲苯代替物20min，第一缸100％乙醇5min，第二缸100％乙醇5min，第三缸100％乙醇5min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，水洗5min x2。

5）3%H 2 O 2室温孵育10min（以消除内源性过氧化物酶的活性）（提前配制3%H 2 O 2，30% H 2 O 2稀释10倍），水洗5min x2。

6）抗原修复，将切片浸入0.01M柠檬酸缓冲液，微波中最大火力加热3min，暂停，再加热2min，冷却40min，PBS（使用PBS洗涤时，可加tween20浓度为0.05%）洗5min x2。

PBS洗涤时根据不同目的蛋白，可加tween20，可不加tween20，本实验中具体使用如下：7）0.05% TritonX-100室温孵育10 min，PBS洗5min x2。

8）将组织周围用棉签擦干，用免疫组化专用笔画圈圈住组织，防止后面反应液流出组织。

9）5%血清（PBS 稀释）封闭，室温摇床孵育30 min。

血清来源与二抗来源动物一致。

本实验中不同血清使用情况如下表：10）甩去封闭液体，滴加一抗（血清封闭液稀释）工作液，室温摇床5min，置于4℃冰箱过夜。

一抗稀释倍数，及4℃冰箱过夜次数如下表：11）PBS洗5min x3，滴加二抗（anti-mouse、anti-rabbit均用PBS稀释200倍），室温摇床1h。

PBS洗5min x3。

12）加strepavidin（PBS稀释500倍），室温摇床1h，PBS洗PBS洗5min x3。

13）DAB显色剂显色，10min，1mlA液（DABbuffer）+1滴B液（DAB）。

水洗3min x2。

14）苏木素复染10min，水洗10mi n x3。

免疫组化流程---袁燕平以下步骤为本人免疫组化常用步骤，流程与常见流程无异，流程如下；1 脱蜡---脱蜡前首先烤片10分钟，二甲苯1，2，3，各10分钟。

二甲苯应该经常更换！2 水化---梯度酒精至水，100％5分钟，100％5分钟，95％3分钟,85％3分钟,75％3分钟，自来水流水冲3分钟。

注意冲水时水量不宜过大，细流即可！3 抗原修复---采取微波加热修复，修复液为柠檬酸盐溶液（最常用），具体方法为：先将修复液加热至沸腾，然后放入玻片，先使用中火8分钟，然后低火8分钟。

一般要求热修复时间达到15分钟才能达到比较好的抗原修复作用。

请注意：在抗原修复完成之后要求玻片上组织一直保持湿润，千万不能出现组织风干的情况。

部分抗原分子可无需进行抗原修复。

4 冷却---一般采取流水降温冷却法，即将容器置于自来水流水中缓慢降温，降温不宜过快，30分钟为好。

部分实验室采取自然冷却法。

5 灭内源性过氧化物酶---注意此时开始一直将玻片置于湿盒中保湿！滴加液体前先用免疫组化专用笔绕组织涂画一圈，甩干组织上的水分，用力不要过猛，然后滴加3％的过氧化氢-甲醇溶液（或者医用3％的过氧化氢），室温15min。

（因为免疫组化中使用的显色液的主要成分为过氧化氢，灭酶可以避免假阳性的出现）。

随后PBS洗3次3分钟。

6 封闭---甩干组织上的液体，滴加与二抗来源相同的非免疫血清（兔血清常用），室温封闭20分钟。

提前配制一抗，使用抗体稀释液（或PBS）按1:100-400（酌情）比例稀释一抗。

每块组织滴加10-30ul体积抗体即可，每次使用前必须新鲜配制，抗体稀释后尽快使用。

7 孵一抗---不需PBS洗，可甩干组织上的液体并滴加合适稀释度的一抗， 4度过夜孵育。

8 复温---将湿盒从冰箱拿出置于室温中15分钟。

PBS洗3次3分钟。

9孵二抗---甩干组织上的液体，滴加二抗，每张切片约滴加10ul即可，注意液体面积要大于组织面积，否则显色时出现边缘效应（假阳性），37度孵育30-60分钟。

免疫组化实验步骤1.溶解和固定样本：首先，将需要检测的细胞或组织样本固定在载玻片上。

最常用的固定剂包括甲醛和乙醇，固定时间可根据样本类型和大小来决定。

2. 渗透化处理：固定后的样本往往会产生较大的凝胶，渗透化处理是为了增加抗体的进入和细胞膜蛋白的释放。

渗透化处理一般使用皂类化合物如Tween-20、Triton X-100或SDS。

3.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要进行阻断。

使用一种含有蛋白质（如牛血清白蛋白、胶原蛋白等）的缓冲液，将玻片上的固定样本浸泡数十分钟至数小时。

4.抗原恢复：一些蛋白质长时间固定后可能会导致其变性或掩盖其一些结构域，这种情况下需要进行抗原恢复。

抗原恢复有两种常见方法，热水浴和酶消化。

前者将玻片放在含有缓冲剂的热水中，后者则经过酶消化处理，例如使用胰酶。

5.抗体孵育：将特异性一抗加入到含有抗体绑定缓冲液中，然后将其滴加到玻片上，孵育在温和的条件下一段时间（通常为1小时至过夜）。

抗体结合到样本中的特定抗原上。

6.洗涤：洗涤步骤是为了去除非特异性结合的一抗和其他蛋白质。

使用含有适当洗涤缓冲剂（如磷酸盐缓冲液或PBS）的盛满容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次。

8.再次洗涤：同样地，使用含有适当洗涤缓冲液的容器，将玻片在其中轻轻漂洗数次，去除非特异性结合的二抗。

9.信号放大：添加一种可视化或发光的底物使得免疫反应可见。

通常使用的方法有酶标记二抗、荧光染料标记的二抗或放射性标记的二抗。

10.显微镜观察：在光学显微镜下观察和记录实验结果。

使用显微镜观察样本，根据信号强度和位置对阳性和阴性结果进行评估。

这些步骤是一般免疫组化实验的基本步骤，但每个实验都有特定的条件和需求，可能需要对步骤进行修改和优化。

免疫组化相关步骤免疫组化是一种常用的组织学检测方法，通过使用特异性抗体标记目标蛋白的方法，来检测该蛋白在组织中的存在和分布情况。

以下是免疫组化的一般步骤：第一步：固定组织样本首先，将需要检测的组织样本进行固定处理，通常使用的固定剂是10%中性缓冲福尔马林（neutral buffered formalin，NBF）。

组织固定可以保持细胞和组织的形态结构，防止其在处理过程中的破坏。

第二步：脱水和石蜡浸渍固定后的组织样本需要经过脱水和石蜡浸渍处理，以便能够在切片时保持其形态。

首先使用不同浓度的乙醇进行脱水处理，然后将组织样本置于融化的石蜡中，使其充分浸渍。

脱水和石蜡浸渍的目的是将组织中的水分替换成石蜡，以便在切片时能够获得高质量的组织切片。

第三步：制备组织切片在将组织样本进行脱水和石蜡浸渍后，使用组织切片机将组织样本切成薄片。

通常使用的厚度为4-6微米的切片。

制备组织切片时需要注意保持切片的完整性和减少组织切片之间的花样。

第四步：脱蜡和再脱水经过组织切片制备后，需要进行脱蜡和再脱水处理，以便后续的免疫染色。

脱蜡处理通常使用木油（xylene）或等效溶剂来去除石蜡，并进行再脱水步骤以去除木油。

第五步：抗原修复抗原修复是免疫组化中非常重要的一步。

组织固定和石蜡包埋可以对目标蛋白的抗原性造成一定的损害，抗原修复通过将切片置于酶解剂（如胰蛋白酶）或缓冲盐溶液中加热，修复抗原，使其更易于抗体识别。

第六步：阻断非特异性结合第七步：抗体孵育在进行免疫染色之前，需要将特异性抗体添加到切片上，与目标蛋白结合。

免疫组化可以使用多种抗体，包括一抗（primary antibody）和二抗（secondary antibody）。

一抗是与目标蛋白直接结合的抗体，而二抗则与一抗结合，其本身标记有酶标记物，如辣根过氧化物酶，或荧光标记物。

第八步：信号可视化和显色完成抗体孵育后，需要使用适当的显色试剂将抗体信号可视化。

显色试剂可以是一些酶标颜色反应法，例如使用DAB（3,3'-联氨基苯并噻唑啉-4,5′-二羧酸）进行显色；或者是荧光探测试剂，通过激光共聚焦显微镜或荧光显微镜来观察。

免疫组化流程免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种通过检测组织中特定抗原蛋白的存在和定位的技术。

它在病理诊断、研究和药物开发中起着重要作用。

免疫组化流程主要包括标本处理、抗原修复、抗体染色和结果分析等步骤。

首先，标本处理是免疫组化流程中的第一步。

组织标本通常是从病理切片或细胞培养物中获取的。

标本需要经过固定、脱水、透明化等处理，以保持组织的形态结构和抗原的完整性。

固定可以使用福尔马林或其他化学试剂，脱水则是将组织中的水分逐渐置换为透明剂，如醇和二甲苯。

透明化后，标本被包埋在蜡块中，使其能够被切片。

接下来是抗原修复步骤。

在标本处理过程中，抗原可能会因为固定和包埋的影响而发生变性或者掩盖。

因此，需要通过加热或酶处理等方法来修复抗原。

常用的抗原修复方法包括热诱导抗原修复（heat-induced epitope retrieval, HIER）和酶诱导抗原修复（enzyme-induced epitope retrieval, EIER）。

这些方法可以使抗原重新暴露，提高抗体的结合效率。

随后是抗体染色步骤。

选择合适的一抗和二抗是关键。

一抗是指直接与目标抗原结合的抗体，而二抗则是与一抗结合的抗体。

在染色过程中，一抗首先与标本中的抗原结合，然后通过二抗与标记物（如酶、荧光物质）结合，形成可见的染色产物。

常用的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。

染色后，标本需要经过反染、脱水、透明化等步骤，最终被封片封存。

最后是结果分析步骤。

通过显微镜观察染色后的标本，评估抗原的表达情况和定位。

根据染色的强度、范围和细胞定位等信息，对标本进行定性和定量分析。

结果分析还需要结合临床和病理信息，最终得出诊断或研究结论。

总的来说，免疫组化流程是一个复杂而精细的过程，需要严格控制各个步骤，确保结果的准确性和可靠性。

只有在规范的操作下，免疫组化技术才能发挥其在疾病诊断和研究中的重要作用。

免疫组化步骤取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋)、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体一、取组织二、固定三、制片1、脱水透明的酒精梯度和时间70%酒精20min 80%酒精1h90％酒精1h 95％酒精Ⅰ2h95%酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min二甲苯酒精1:1 15min 二甲苯Ⅰ25min二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min2、浸蜡:石蜡融化后,在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h3、包埋四、切片烤片用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时五、脱蜡至水六、抗原修复配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸,在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖)，将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中,盖上锅盖,待其压力达到最大时维持三分钟七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数）,4℃过夜十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液，每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min十一、PBS冲洗2分钟×3次,除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物,室温孵育10min十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB(二氨基联苯胺），室温孵育2~10分钟,显微镜观察十三、苏木精复染:苏木精复染5min，水洗3min，0.1％HCl浸提两次，水洗3min，反蓝液数秒，水洗十四、脱水透明:70％酒精3min、80%酒精3min、90%酒精3min、无水乙醇3min、二甲苯Ⅰ3min、二甲苯Ⅱ3min十五、封片。

免疫组化实验步骤1.血样制备：-采集血液样本，离心分离血浆或血清。

-用PBS洗涤血浆或血清，去除杂质。

2.组织固定：-采集待检组织样本，用缓冲福迪液进行固定。

常用的福迪液包括4%的甲醛和10%的中性缓冲福迪液。

-将组织固定在玻片上，通常通过石蜡包埋来保护组织样本。

3.切片：-使用旋转式或电动切片机将固定的组织切割成5-10μm厚的切片。

-将切片放置在带有去福迪剂密封的玻片上，然后进行脱脂和重水处理。

4.抗原恢复：-将切片浸泡在适当的抗原恢复缓冲液中，以恢复切片中的抗原结构。

-常用的抗原恢复方法包括热敏感抗原恢复、酶消化抗原恢复和酸碱抗原恢复等。

5.阻断非特异性结合位点：-使用适当浓度的蛋白抑制剂（如牛血清蛋白）在切片上进行阻断，防止非特异性结合。

-将切片在室温下孵育一段时间，以使蛋白抑制剂有效阻断非特异性结合。

6.抗体染色：-添加特定的初级抗体到切片上，与待检测的特定抗原结合。

-孵育切片，使初级抗体与抗原结合。

-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的抗体。

7.信号放大：-添加合适的二级抗体到切片上，与初级抗体结合。

二级抗体可标记有荧光染料、酶或金粒等。

-孵育切片，使二级抗体与初级抗体结合。

-将切片用PBS或缓冲盐水洗涤去除未结合的二级抗体。

8.检测与成像：-根据二级抗体标记的方式，使用合适的检测方法进行信号放大。

-如果使用荧光标记的二级抗体，可以利用荧光显微镜观察和拍摄图像。

-如果使用酶标记的二级抗体，可以使用底物和显色试剂进行检测和成像。

9.结果分析：-观察并分析免疫组化染色结果，评估抗原的定位和表达情况。

-可以使用计算机图像分析系统进行定量分析和比较。

10.结论和报告：-根据实验结果，得出结论并撰写实验报告。

-将实验结果与已知文献资料进行对比和解释，讨论可能的研究价值和应用前景。

注意事项：-实验过程中需严格遵守无菌操作规范，以避免交叉污染和误差。

-选用合适的正对照和阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。

免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。

它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。

以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。

2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。

3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。

4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。

脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。

2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。

抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。

2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。

阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。

一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。

一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。

2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。

4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。

5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。

洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。

2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。

可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。

2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。