实验一：酵母菌大小测定
一、实验器材
1、菌种：酵母菌液体培养物
2、仪器和其他物品
目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸，载玻片，滴管等。
二、实验目的及要求
1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。
2、掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。
三、基本原理
微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。
微生物大小测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。
镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。
镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格地相对长度。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。
测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。
四、操作步骤
1、装目镜测微尺(换目镜)
把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝上放在目镜镜筒内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。
※双目显微镜的左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下，因此使用双目显微镜时
目镜测微尺一般都安装在右目镜中。
2、校正目镜测微尺
（1）放镜台测微尺
将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。
（2）校正
先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。
利用移动器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，然后数出两重合线之间镜台测微尺和目镜测微尺所占的格数。
用同样的方法换成高倍镜进行校正，测出在高倍镜下，两重合线之间两尺所占的格数。
（3）计算
目镜测微尺每格长度（um）=两重合线间镜台测微尺格数x10 / 两重合线间目镜测微尺格数
3、菌体大小测定
目镜测微尺校正完毕后，取下镜台测微尺，换上酵母菌染色制片。
先在低倍镜下找到标本，换高倍镜测定酵母菌的宽度和长度。
测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出酵母菌的直径或宽和长所占目镜测微尺的格数。
最后将所测得的格数乘以目镜测微尺（在高倍镜下）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。
※和动植物一样，同一种群中的不同细菌细胞之间也存在个体差异，因此在测定每一种细菌细胞的大小时应至少随机选择10个细胞进行测量，然后计算平均值。
※球菌用直径来表示其大小；杆菌则用宽和长的范围来表示。
例如，金黄色葡萄球菌只需要测量其细胞的宽度（直径），而枯草芽孢杆菌和迂回螺菌应分别测量细胞的宽度和长度，但应注意对杆菌可测量细胞的直接长度，而对螺菌测量的应是菌体两端的距离而非细胞实际长度。
4、测定完毕
取出目镜测微尺后，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦试干净，放回盒内保存。
五、实验结果及反思
表一目镜测微尺校正结果
物镜物镜倍数目镜测微尺格数镜台测微尺格
数
目镜测微尺每格代表
的长度/μm
低倍镜10 60 58 9.67
高倍镜40 97 24 2.47
表二酵母菌大小测定记录
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 宽度9.0 5.5 5.5 7.8 6.8 8.0 4.0 6.5 8.2 5.6 长度9.5 6.2 6.0 8.0 7.2 9.5 4.5 7.3 9.0 6.2
酵母菌 2.47 6.69 16.52μm 7.34 18.13μm 16.52*18.13
实验二酵母菌显微镜直接计数
一、实验器材
1、菌种
酵母菌液体培养物
2、仪器及其它用品
普通光学显微镜，血球计数板，盖玻片，擦镜纸，吸水纸，无菌滴管，移液管，试管，三角烧瓶等。
※显微镜直接计数法适宜对能在液体中均匀分散的微生物细胞或孢子的数量进行直接计数。
通常使用的血球计数板不适合用油镜，因此本实验推荐使用个体较大的酵母菌细胞作为实验材料，以保证观察效果。
二、实验目的要求
1、学习并掌握使用血球计数板测定微生物或孢子数量的方法。
三、基本原理
显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上（又称计菌器），于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。
目前国内外常用的计菌器有：血球计数板、Peteroff-Hauser计菌器等。
显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如酵母、细菌、霉菌孢子等。
菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板。
血球计数板计数板是一块特制的载玻片，其上有四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。
计数室规格：
25（中格）×16（小格）
16（中格）×25 （小格）
每种规格计数室中的小方格都是400个。
计数室大小：
每一个大方格边长为1mm，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。
因此：以本次使用的25个中方格为例
1mL菌悬液中含有细胞数=五个中格总菌数(A)/5×25×104×稀释倍数(B)
四、操作步骤
1.君悬液制备
蒸馏水适当稀释制备酿酒酵母菌悬液；
2.镜检血球计数板；
3.加样品
血球计数板盖上盖玻片，将酵母菌悬液摇匀，用无菌滴管吸取少许，从计数板平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一滴，利用表面张力沟槽中流出的多余菌悬液;
※取样时先要摇匀菌液，加样时计数室不可有气泡产生。
4.显微计数
静置5min，将血球计数板置载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区，再转换高倍镜观察并计数；
如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差;对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算;
5.清洗血球计数板
用毕后，自来水冲洗干净，蒸馏水冲洗一遍。
※由于计数板伤得计数室刻度非常精细，勿用硬物洗刷，也不可用酒精灯火焰烘烤计数板，洗完后自行晾干或至40℃下烘干。
五、实验结果及反思
※反思：
1、在显微镜下找方格线时，应注意光圈的调整。
在本实验中就因为光圈太大，结果造成始终看不到方格线，或者能够看到方格线，但看不到菌体。
2、在测量时可以将菌液稀释成至少三个不同浓度梯度，从中找到最适合的浓度梯度。
体现在最后的计数结果上，不同梯度下的计数结果可能有所不同，但数量级应该一样，否则视为计数结果不准确。
