乳鼠肾细胞原代培养传代培养

动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。

说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。

2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。

你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。

不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。

2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。

咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。

提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。

然后，把这些细胞放到培养基里。

培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。

要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。

培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。

咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。

如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。

这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。

传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。

3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。

通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。

这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。

接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。

注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。

动物细胞的原代及传代培养一、试验目的1、了解动物细胞原代培养的原理及基本方法，掌握组织块法及消化培养法的操作过程，掌握无菌操作的技术要领；2、了解传代培养方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长情况。

二、实验原理动物细胞的原代培养是指把直接从动物获得的细胞、组织或器官在体外培养直至第一次传代为止。

要求在严格无菌的条件下对动物进行切割成组织块或经消化液使组织细胞游离为单个细胞，然后在人工配制的营养液内使其不断地生长和繁殖。

传代培养是指将细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移、接种到另一培养瓶的培养过程。

三、实验材料和试剂鸡胚，HeLa细胞实验器材：无菌工作台，细胞培养箱，离心机，无菌解剖器材，培养皿，培养瓶，滴管等。

实验试剂：平衡盐液，细胞消化液，培养液四、实验步骤（一）动物细胞的原代培养1、取材①将鸡蛋用酒精消毒，用剪刀敲破鸡蛋的圆端，剥壳去膜，倒掉壳内的液体；②拉出鸡胚，剪去头后置于装有Hank液的培养皿内，用Hank液清洗；③然后用镊子小心拔掉鸡胚的毛，将拔完毛的鸡胚。

2、组织块培养法①剪取背部及大腿部的皮肤肌肉组织十余块于培养皿中，用剪刀剪成1mm3大小的组织块；②用弯头吸管吸取组织块送入培养瓶底部，均匀排列；③翻转培养瓶后吸取3管培养液，滴入到培养瓶内（注意：吸管不能碰到瓶口）；④标记在培养瓶写上“原代”，写上姓名和学号。

3、消化培养法①剪取十余块组织块放入干净的培养皿中，吸取3-5管消化液，放入37℃的培养箱中消化10-20min，到组织变成松散、粘稠状，然后加入1管营养液（停止消化）；②取一只干净的细管将组织块打散，放置一段时间，用吸管吸取上清液于离心管中，离心10min；③倒掉上清液，用营养液悬浮沉淀，转入干净的培养瓶中，加入适量的培养液，37℃的培养箱中培养；④标记在培养瓶写上“消化”，写上姓名和学号。

（二）动物细胞的传代培养①取已长成单层HeLa细胞的培养瓶，倒掉培养液，加入3管消化液，37℃条件下消化2-5min，在显微镜下观察细胞单层出现缝隙，倒去消化液，停止消化；②加入3-4管培养液，用弯头吸管反复吹打壁上的细胞层（尽量不形成气泡），添加2-4管培养液；③用吸管吸取一半左右细胞悬液，分装到另一个培养瓶中；④作标记，注明细胞代号、日期和操作者姓名；⑤37℃静置培养，24小时后即可观察。

BHK-21传代细胞培养BHK是仓鼠肾细胞[原理]细胞在培养瓶壁上长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。

传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。

同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。

[材料和试剂]1、细胞：贴壁BHK-21细胞株2、试剂：0.25％胰蛋白酶、配制好的DMEM培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等[操作步骤]1、应需要计算好培养液的总用量，按10%的比例加入血清，按1%的比例加入双抗。

用7.5%的碳酸氢钠调PH至7.0~7.2左右。

2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。

3、加入0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。

4、瓶口塞好胶塞，平放在实验台上。

约2~3分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙，赶紧将胰酶弃去，加入少量培养液终止消化。

5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打，使其均匀分散成悬液，再加入足量的培养液，分成两到三瓶。

塞好胶塞，置37℃温箱中继续培养。

细胞培养常用溶液的配制一、青、链霉素溶液青霉素钠盐(80万IU／瓶) 5瓶链霉素(100万IU／瓶) 4瓶将两者溶于400ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-20℃保存。

双抗在培养基中的终浓度为100IU/ml为宜。

二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制称取碳酸氢钠7.5g，加入超纯水使总体积为100ml。

高压灭菌，分装于小瓶中，4℃贮存。

三、1%酚红溶液的配制首先配制1mol/L的NaOH溶液。

称取NaOH4.0g，加入100ml超纯水，使NaOH 完全溶解，在室温或4℃贮存（最好现用现配）。

配制好NaOH溶液后，再称取1.0 g 酚红置研钵中，加1mol/L的NaOH（不多于7.0ml），研磨使酚红完全溶解，加超纯水至100ml，高压消毒，在室温或4℃贮存。

四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制氯化钠8.0g氯化钾0.2g柠檬酸钠(Na3C6H5O7•5H2O) 1.12g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O) 0.056g碳酸氢钠 1.0g葡萄糖 1.0g胰蛋白酶（1：250） 2.5g超纯水加至1000ml放4℃冰箱过夜，待胰蛋白酶充分溶解后，用0.2um微孔滤膜过滤除菌，分装于小瓶中，-20℃保存。

动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。

用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。

1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。

2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。

三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。

四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。

2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。

（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。

五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。

2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。

3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。

制的细胞悬液。

六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。

2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。

（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。

RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。

其中含有10%胎牛血清。

）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。

一、实验目的1. 掌握乳鼠细胞传代培养的基本方法；2. 观察乳鼠细胞在体外培养过程中的形态变化；3. 熟悉乳鼠细胞传代培养的注意事项。

二、实验原理乳鼠细胞传代培养是指在体外条件下，将培养的细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶的过程。

通过传代培养，可以扩大细胞数量，保持细胞的遗传稳定性，并研究细胞在不同条件下的生物学特性。

三、实验材料1. 乳鼠细胞；2. 75%乙醇；3. PBS（磷酸盐缓冲盐溶液）；4. 0.25%胰蛋白酶；5. 细胞培养基（DMEM/F12，含10%胎牛血清）；6. 细胞培养瓶；7. 移液器；8. 离心机；9. 显微镜。

四、实验方法1. 准备工作（1）将细胞培养瓶用75%乙醇消毒，然后用无菌PBS冲洗；（2）取适量乳鼠细胞，加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养。

2. 传代培养（1）取出一瓶培养好的乳鼠细胞，用移液器将细胞悬液转移至另一个培养瓶中；（2）加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养。

3. 观察细胞形态（1）取出一瓶培养好的乳鼠细胞，用移液器将细胞悬液转移至另一个培养瓶中；（2）加入适量细胞培养基，调整细胞浓度为1×10^6个/mL；（3）将细胞培养瓶放入二氧化碳培养箱中，37℃、5%CO2培养；（4）每隔一定时间观察细胞形态变化，记录实验结果。

五、实验结果1. 乳鼠细胞在体外培养过程中，细胞形态逐渐从圆形变为扁平状，细胞密度逐渐增加；2. 在传代培养过程中，细胞形态保持一致，细胞密度逐渐增加；3. 观察细胞形态变化，未发现细胞异常。

六、实验讨论1. 乳鼠细胞在体外培养过程中，细胞形态逐渐发生变化，可能与细胞生长、代谢等因素有关；2. 传代培养过程中，细胞形态保持一致，说明乳鼠细胞具有较强的遗传稳定性；3. 在实验过程中，应注意无菌操作，避免细胞污染。

动物细胞传代培养的步骤动物细胞传代培养，这事儿听起来好像很高大上，其实也没那么复杂。

咱们先聊聊，啥是传代培养呢？就是把细胞从一块地方转移到另一块地方，继续让它们生长，简直就像搬家，给它们换个新环境。

准备工作得做好。

这就像你出门前，得先检查钱包、钥匙、手机啥的。

细胞培养液、培养瓶、离心机、培养箱，缺一不可，得齐齐整整的，准备就绪。

然后，咱们得拿到这些细胞。

细胞可不是随便抓来的，它们需要从动物体内提取。

别担心，科学家们有一套方法，取样的过程就像是给小动物们做个健康检查。

提取完毕，把细胞放在培养液里，这时候，细胞们就开始在这个温暖的环境中茁壮成长了，简直像鱼得水。

细胞们就像孩子们，吃得好，长得快，咱们得定期去看看它们的“成长记录”。

到了细胞长得比较多的时候，咱们就得进行传代了。

这就像孩子们上学，得时不时换个班级，跟不同的小伙伴玩。

先把培养瓶里的细胞用离心机转一转，分离出细胞和培养液。

这里有个小细节，离心的时候别太用力，不然细胞就跟打了个旋儿，容易受伤。

分离完毕后，咱们得把细胞用消毒的方式处理一下，确保它们在新环境中能安全无忧。

把细胞重新放进新培养瓶里，加上新鲜的培养液。

这时候，细胞们就像到了新学校，得适应新的环境。

记得在培养箱里调好温度和二氧化碳浓度，给细胞们一个舒适的生活条件。

你想啊，细胞也有它们的小脾气，环境好，才能开心地成长。

每隔一段时间，咱们得去检查一下它们，看看它们的“心情”如何，有没有异常的情况。

细胞传代并不是一件简单的事情，偶尔也会遇到一些小麻烦。

细胞长得太快，空间不够用，就得考虑再传代一次。

这时候可别心急，要有耐心。

细胞就像小朋友，有时候也需要多一点时间去适应。

遇到不健康的细胞，咱们也得果断处理，像是给小朋友的坏习惯做个干脆的了断。

每次传代都是个新的开始，细胞们在新环境中继续生长繁殖，越来越壮大，真是让人感到欣慰。

随着时间的推移，细胞们就像一片森林，生机勃勃。

科研人员也会从中提取到许多有用的信息，就像从孩子们的成长中获取经验教训。

免疫磁珠法分离纯化乳鼠肾血管周细胞王丽;马跃荣【期刊名称】《现代医药卫生》【年(卷),期】2016(032)016【摘要】目的：通过建立肾原代细胞培养，探讨免疫磁珠分离纯化乳鼠肾血管周细胞的方法。

方法选取健康BALB/c乳鼠肾脏，剪碎、消化和过滤制成细胞悬液，原代培养并传代（传3代）。

免疫磁珠法分离出神经胶质细胞2型硫酸软骨素糖蛋白（NG-2）；倒置相差显微镜观察细胞形态特点，免疫细胞化学检测NG-2、平滑肌肌动蛋白（SMA）和CD31表达，BrdU法检测细胞增殖活性，鉴定是否符合周细胞特征及纯化后的细胞是否具有增殖活性。

结果纯化后获取的细胞宽大扁平，形态呈梭形、三角形或多边形并有突起。

细胞核椭圆居中，多为单核，偶为双核，细胞质丰富，无接触性抑制生长，符合周细胞形态及生长特征。

NG-2和SMA免疫细胞化学染色阳性表达，CD31免疫细胞化学染色阴性表达，符合周细胞特点。

分离纯化后的细胞48、72 h细胞增殖率分别为（0.37±0.11）%、（0.42±0.10）%。

结论免疫磁珠法可使周细胞从细胞成分复杂的肾组织中分离出来，并具有生物活性，可继续体外培养，为后续研究提供参考依据。

%Objective To establish the primary culture by renal cells and to investigate the isolation and purification method of sucking mice renal vessel pericytes by the imunomagnetic bead technique. Methods The kidney of healthy BALB/c sucking mice was selected,cut into pieces,digested and filtered for preparing the cellular suspension. The primary culture and passage(3 generations)were performed;the mimunomagnetic bead techniqueisolated neurogliocytes(NG-2);the inverted phase contrast microscope was adopted to observe the cellular morphological characteristics ,the immunohistochemistry was used to detect NG-2,SMA and CD31 expression by joint judgement,the cellular proliferation activity was detected by using the BrdU method. Whether meeting pericytes characteristics and whether purified cells having the proliferation activity were identified. Results The cells obtained by purification were wide and flat,the morphologies were fusiform, triangle or polygon with prominence. The cellular nucleus was ellipse and in the middle,the majority were mononucleus,occasionally bi-neucleus,with plentiful cytoplas-ma,without contacting inhibition growth,which conformed to the pericytes morphology and growth characteristics. NG-2 and SMA were positively expressed by immunocytochemical staining,CD31 was negatively expressed,which conformed to the pericytes characteristics. The 48,72 h proliferation activities of isolated and purified cells were (0.37±0.11)%and (0.42±0.10)%respec-tively. Conclusion The imunomagnetic bead method can make the pericytes to be isolated from the kidney with complex cellular compositions,which have biological activity,can continuously culture in vitro and provide the reference basis for subsequent study.【总页数】3页(P2453-2455)【作者】王丽;马跃荣【作者单位】成都中医药大学附属医院病理科，四川成都610036;成都中医药大学附属医院病理科，四川成都610036【正文语种】中文【相关文献】1.免疫磁珠法原代分离培养大鼠视网膜微血管周细胞 [J], 王应利;郭斌;惠延年;张晓光;陈立军;马吉献2.免疫磁珠法分离纯化人肾癌CD133+细胞实验研究 [J], 吴恭瑾;卢建忠;杨宁强;杨发英;岳中瑾3.免疫磁珠法在分离纯化外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群中的应用 [J], 莫雪安;周礼圆;秦超;张德敏;赵伟金4.免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓源运动神经元的方法探讨 [J], 王菲; 王春芳; 李鹏飞; 蔚洪恩; 韩树峰; 李承罡5.免疫磁珠法分离纯化胚胎大鼠脊髓源运动神经元的方法探讨 [J], 王菲; 王春芳; 李鹏飞; 蔚洪恩; 韩树峰; 李承罡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一小鼠肾脏原代细胞的分离及细胞计数(一)原理细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。

由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。

原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。

一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

(二)操作1．取材用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。

然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肾脏。

置于无菌平皿中。

2．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。

移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

3．消化吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。

4．制备单细胞悬液向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3 ml PBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。

5．细胞计数1 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

3 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。

4 计算原细胞悬液的细胞数（按照下面公式计算细胞密度）：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

小鼠胚胎细胞的原代与传代培养及观察南京师范大学生命科学学院09070150 唐嘉艺摘要：细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一，可以分为原代培养和传代培养两种。

原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。

由于细胞刚从活体组织中分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。

这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后的传代培养创造条件。

传代培养是组织培养常规保种方法之一。

当细胞在培养在培养瓶中长满之后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长。

这一过程就叫传代。

传代培养可获得大量细胞供实验所需。

传代培养要在严格的无菌条件下进行。

本次实验主要是为了培养能独立进行细胞的原代和传代培养的能力，熟练掌握进行细胞原代与传代培养的条件、实验材料、方法等。

关键词：小鼠胚胎原代培养传代培养无菌前言：在体外培养中，有三个培养层次，即细胞培养、组织培养和器官培养。

细胞培养是指从体内取出组织，经消化酶消化成单细胞或细胞群，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使细胞生存和生长并维持其结构和功能的方法。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外生长，必须满足一下的基本要求：一、供给细胞存活所必需的营养条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气等。

二、要有适合各种细胞生长的适宜温度，并注意细胞生长环境的酸碱度与渗透压的调节。

三、细胞培养必需严格控制在无菌条件下。

细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。

培养细胞所用器材及试剂：1、设备（1）超净工作台（2）滤器（3）C O2培养箱（4）电热干燥箱2、器械及器皿：培养瓶、培养皿、滴管、镊子、手术剪3、培养液：目前常用的基础培养基均已商品化，如RPM1640，MEM，M—199等，可根据培养需求合理选择。

血清：一般常用为小牛血清，人血清和其它动物血清。

平衡盐溶液：主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。

专利名称：一种提取乳鼠肾原代细胞的方法专利类型：发明专利
发明人：刘立峰
申请号：CN202110212323.7
申请日：20210225
公开号：CN112725262A
公开日：
20210430
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种提取乳鼠肾原代细胞的方法，其包括如下步骤：(1)处理乳鼠获得乳鼠肾脏；(2)将肾脏剪成数块后再次用PBS溶液洗涤一次，吸除PBS溶液并将肾脏剪碎，先加入含胰酶的第一消化液，消化处理8‑12min,然后再加入含胶原酶的第二消化液，消化处理15‑20min,然后过滤得悬液；(3)将悬液进行离心处理，加入红细胞裂解液处理后终止消化，然后加入细胞完全培养基进行重悬，贴壁去除巨噬细胞；(4)细胞培养，长到需要的程度，即得。

优点为，依次使用低浓度的含胰酶的第一消化液和适宜浓度的含胶原酶的第二消化液对乳鼠的肾脏剪碎组织进行消化处理，综合二者优点，处理效率高且保证对细胞的损伤小，可获得纯度较高且活性较好的乳鼠肾原代细胞。

申请人：武汉博尔夫生物科技有限公司
地址：430000 湖北省武汉市武昌区民主路428号2栋4楼423号
国籍：CN
代理机构：武汉谦源知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：王力
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一小鼠肾脏原代细胞的分离及细胞计数(一)原理细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。

近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。

由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。

原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。

一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。

(二)操作1．取材用颈椎脱位法使小鼠迅速死亡。

然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。

用消过毒的剪刀剪开用乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肾脏。

置于无菌平皿中。

2．切割用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1 mm左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。

移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。

3．消化吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1 ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化30分钟，每隔5分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清。

4．制备单细胞悬液向含有经消化的肾组织的离心管中加入2-3 ml PBS，用吸管吸打数次，直到看不到块状组织。

5．细胞计数1 盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。

2 将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

3 统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数目。

4 计算原细胞悬液的细胞数（按照下面公式计算细胞密度）：（细胞悬液的细胞数）/ml＝（四个大格子细胞数/4)×104说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

乳鼠肾细胞的培养个人体会乳鼠肾细胞培养是一种常用的细胞培养技术，用于研究和理解生物学过程以及药物筛选等应用。

通过培养乳鼠肾细胞，可以获取大量的细胞，进行进一步的实验和分析。

在进行乳鼠肾细胞培养时，首先需要选择合适的培养基。

一般常用的培养基是含有营养物质和生长因子的DMEM/F12。

培养基的选择对于细胞的生长和增殖具有重要影响。

接下来，需要将乳鼠肾细胞取出并进行传代。

传代是将细胞从一个培养瓶转移到新的培养瓶中，以保证细胞的生长和增殖。

传代时，需要使用胰蛋白酶等消化酶将细胞与培养瓶表面分离，并进行离心洗涤。

在培养过程中，细胞需要在适当的温度、湿度和气体环境下生长。

一般来说，细胞培养室保持在37℃、5% CO2和95%湿度的条件下。

这样的环境可以提供最适合细胞生长的条件。

细胞的培养还需要定期更换培养基，并观察细胞的形态和数量。

细胞形态的变化可以反映其生长状态和健康程度。

当细胞达到一定的密度时，可以进行细胞的分离和传代，以保持细胞的正常生长。

我个人在进行乳鼠肾细胞培养的过程中，发现了几个关键点和注意事项。

首先，确保细胞的无菌条件是非常重要的。

任何细菌、真菌或病毒的污染都会影响细胞的生长和实验结果。

因此，在培养过程中，我始终保持消毒操作，并注意细胞培养器具的清洁和无菌处理。

其次，培养基的配制和使用要精确。

每种细胞株对培养基的要求可能有所不同，因此要根据具体情况调整培养基的成分。

同时，要注意避免培养基的过度或不足，以免影响细胞的生长和增殖。

此外，培养过程中的细胞密度和传代的次数也需要控制。

细胞密度过高或传代频繁可能会导致细胞的老化和凋亡。

因此，要根据具体需要和细胞的生长状态灵活调整细胞密度和传代的时间。

最后，细胞培养的成功还需要耐心和细心的观察和记录。

通过不断观察细胞的形态和数量的变化，可以及时发现细胞的异常和问题，并采取相应的措施进行调整和修复。

总的来说，乳鼠肾细胞的培养是一个需要细心和耐心的过程。

通过合理的培养条件和操作方法，可以成功地培养出大量健康的细胞，并进行进一步的实验和分析。

乳鼠肾细胞的原代培养及传代培养生64班范泓洋30060300031. 实验目的a)掌握原代细胞培养的原理与操作方法，了解无菌操作的条件和注意事项；b)了解并通过实践学习处死与解剖乳鼠和识别、取出乳鼠肾脏的方法；2. 实验原理新生约3天的乳鼠体内的组织与器官均没有发育成熟，处于旺盛的分裂生长时期，因此是用作细胞培养的良好材料，适当的培养就可以观察到贴壁和分裂增殖现象。

由于肾脏的细胞类型较为单一并且肾脏本身易于从乳鼠体内取出，将肾作为实验材料是较好的选择。

在进行细胞培养之前，首先要从组织中提取出大量的分散的单细胞并制备成细胞悬液。

这就需要首先破坏细胞外基质以及细胞连接对组织细胞的“束缚”。

胚胎或新生动物的组织中细胞外基质和细胞连接并没有充分形成，这也是将新生动物作为实验材料的原因之一。

具体的方法是用蛋白酶例如胰蛋白酶（trypsin）或胶原酶（collagenase）和乙二胺四乙酸（EDTA）处理组织，使之成为单细胞。

胰蛋白酶作用于肽链的Lys或Arg残基的羧基末端，将肽链水解为长短不同的几段；在胎儿发育过程中活性很强的脊椎动物胶原酶（vertebrate collagenase）能够催化胶原蛋白在Gly-Leu和Gly-Ile键处水解，将其裂解为一个较大的N端片断（75%）和一个较小的C端片断（25%）。

这两种酶可以达到有效降解细胞间质蛋白的目的。

EDTA是钙离子螯合剂，而Ca2+在细胞粘连中起到了关键性的作用，去掉有助于肾细胞脱落。

用酶解的方法能够使细胞从原有组织中脱落并保持生命力，本实验正是采用了这样的方法。

3. 实验材料、用品和仪器超净工作台、倒臵显微镜、二氧化碳培养箱、水浴锅、高压灭菌锅、离心机、滤器酒精灯、酒精棉、镊子、器械缸、废液缸、记号笔，蜡盘、大头针、眼科剪、眼科镊，移液器架、移液器、吸头，试剂瓶、试剂瓶架，平皿、细胞培养瓶、离心管等PBS溶液，0.25%胰蛋白酶—0.02%EDTA溶液，DMEM培养基（含10%小牛血清及双抗）4. 实验步骤4.1 将乳鼠（3天左右）断头放血致死。

小鼠肾脏足细胞的原代培养和鉴定高霞;雷晓燕;刘姝娆;索艳红;曹晓锋;高明东【摘要】目的:建立可操作性好、简单易行且效率较高的小鼠肾脏足细胞分离及原代培养模式,为其进一步研究奠定基础.方法:取C57/BL6J小鼠肾脏,通过差异过筛法获取300目筛的肾小球,用制备好的KI-3T3培养基重悬肾小球后静置于铺被鼠尾胶原的培养皿中,4d后开始换液,7d后开始胰蛋白酶消化肾小球,并开始足细胞传代培养.5～7 d传代1次,传代2～3次后收集细胞鉴定.采用倒置扭转显微镜观察小鼠肾脏足细胞形态表现,采用PCR法检测小鼠肾脏足细胞中nephrin,podocin和P-cadherin的表达.结果:肾小球种植3d后可见足细胞从组织中爬出,足细胞传代培养7d后在倒置相差显微镜下可观察到细胞胞体有突起生长.PCR法检测,分离培养的足细胞表达nephrin、podocin和P-cadherin.结论:差异过筛结合消化酶技术能够成功分离培养C57/BL6J小鼠肾脏足细胞.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2017(043)001【总页数】5页(P186-189,后插4)【关键词】肾脏;足细胞;原代培养【作者】高霞;雷晓燕;刘姝娆;索艳红;曹晓锋;高明东【作者单位】甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省中医药大学研究生处,甘肃兰州730000;宁夏医科大学研究生学院,宁夏银川750000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000;甘肃省人民医院儿科,甘肃兰州730000【正文语种】中文【中图分类】Q813.11研究[1-2]表明：足细胞损伤是导致大量蛋白尿发生的关键环节。

有关足细胞的研究是肾脏病领域的热点内容，但目前足细胞的原代技术仍十分有限，已有的报道主要局限在大鼠足细胞的分离及培养方法，有关小鼠足细胞原代培养技术少见报道。

C57/BL6J小鼠是建立基因敲除模型的主要模式动物[3]，是实现基因敲除或基因敲入动物成模的关键动物品系。

细胞工程综合实验报告小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养班级 xxxx姓名 xxxx学号 xxxxxxxxxx指导教师 xxxx实验时间 xxxx成绩小鼠腹腔巨噬细胞和肾脏细胞的原代培养姓名学号班级一、实验目的1.了解细胞原代培养培养的基本方法和操作过程。

2.初步掌握培养过程中的无菌技术。

3.了解在相差显微镜下观察培养细胞的形态和生长状况。

二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织和器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分解成单个游离细胞，在人工培养下，使其不断的生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二是严格控制无菌条件。

巨噬细胞属天然免疫细胞，具有趋化运动、吞噬、分泌和参与免疫调节等功能，是科学工作者研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。

巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。

巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周多用做原代培养，不易长期生存。

巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。

目前，单核巨噬细胞株也有，比如RAW264.7，但价格比较贵，且保存也不方便。

培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞，目前以小鼠腹腔取材法最为实用，而目前获取小鼠巨噬细胞的方法有两种，一种是直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞，还有一种方法向动物腹腔中注射刺激物（如牛血清，淀粉，糖原，脂多糖，矿物油，PRMI1640培养液等），这样使机体产生大量巨噬细胞后再腹腔灌洗，但由于许多刺激物能激活巨噬细胞，而被激活的巨噬细胞大量吞噬刺激物，有此得到的巨噬细胞培养用于培养时，细胞中的刺激物不能很快被消化而残留在细胞中，影响细胞代谢，同时也不能很好的模拟体内环境，所以我们直接用培养液灌洗实验动物腹腔，从腹腔灌洗液中分离巨噬细胞。