植物冰冻切片制作及显微观察
一实验原理
冰冻切片是利用低温使组织迅速冻结达到一定的硬度进行切片
的一种方法，因其不需经过脱水和透明等步骤，具有快速、简便、易操作等特点，而且能比较好地保存组织的酶活性，较完好地保存组织抗原的免疫活性，是原位杂交、酶组织化学和免疫组织化学等实验中常用的方法。冰冻切片的种类较多，常用的切片机主要分为两大类：开放式冰冻切片机和恒温冰冻切片机。前者主要包括半导体制冷切片机、醇制冷切片机及老式CO2、氯乙烷等切片机等，开放式冰冻切片机由于暴露于空气中，温度不易控制，技术难度大，现多已淘汰。后者主要是低温恒冷箱冰冻切片法，是目前应用最为广泛的方法。
冰冻切片在动物和人体的研究中已被广泛应用，但在植物上的应用相对较少。原因是植物组织中存在液泡结构，而且由于细胞壁的存在细胞之间有较大间隙，细胞含水量远大于相同体积的动物细胞，更容易在低温冷冻过程中形成冰晶，损伤植物细胞的细微结构且比较容易破碎，难以切片和保持植物组织结构的完整性，也使得准备植物组织的冰冻切片存在一定的困难。因此，在植物材料进行冷冻切片时常使用冷冻保护剂进行处理。冷冻保护剂的作用就是能与组织细胞中的水分结合，降低细胞内溶液的冰点，使形成冰晶或较大冰晶的机会减小，从而减轻细胞内冰晶的损伤。常用的的冷冻保护剂有蔗糖和甘油等，不同植物组织细胞结构不同，因此选择适合的保护剂的浓度非常重要。另外，影响植物冰冻切片的主要因素还有包埋剂和切片厚度等，冰冻切片常用的包埋剂有水、普通胶水和OCT，用水做包埋剂，较难切出完整的切片；OCT包埋剂与普通胶水效果基本相同，都能切出完整的切片，如果在冰冻前将材料浸没在OCT或胶水中，让OCT或胶水充分渗透进组织中，切片效果更好。切片不可过厚，否则细胞重叠不易观察；切片也不可过薄，否则切片容易破碎，需根据不同实验材料和实验目的进行优化。
二实验材料
拟南芥茎段
三主要仪器和试剂
l eica冰冻切片机、光学显微镜
OCT、TBO、
四实验方法
1.取新鲜烟草茎段，切成0.5 cm左右的小段
2.取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻
台上，冰冻。
3.将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转
动旋钮，将组织修平。
4.调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄
切，纤维多细胞稀的可稍为厚切。
5.调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要
求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。
6.在干净的载波片上滴上一滴水，用预冷的解剖针将切好的材料挑
起，迅速置于载波片上的水中展片。
7.吸去多余水分，用1% TBO滴染展开的切片材料5s，迅速用水洗去
染料。
8.用80% 甘油封片。
9.显微镜拍照。
五冰冻切片时的注意事项：
1.防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑
除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。
2.当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取
出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大
拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。
3.用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。
因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。
如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。
