western blot转移电泳一般操作流程
总的来说，半干转、湿转的程序和基本原理是相同的。胶和膜预稀释并用电转缓冲液平衡；滤纸/胶/膜/滤纸三明治放入电转设备中；正确的方向确保蛋白转移到膜上。合适的电压/电流条件对于电转的成败是非常重要的。
电转缓冲液和电转条件的选择
对于不同的电转设备，当选用不同的胶和缓冲液时，要求不同的电压/电流。变性凝胶需要增加电转时间，而低分子量的蛋白需要相应的缩短电转时间。现在实验室常用的Bio-rad 小型Mini Trans-Blot转印槽（湿转）和Trans-Blot半干转印系统转印槽（半干转）相应的电转参数如下表：
槽式转印半干转印
Mini Trans-Blot槽Trans-Blot半干转印系统转印槽印迹区域（宽 x 长）10 x 7.5 厘米24 x 16 厘米
转移参数
凝胶夹数 2 -
缓冲液要求450ml ≤200 ml
电极距离4cm 按夹层结构厚度确定
转移时间（高强度）60分钟15–60 分钟
冷却蓝胶冷却装置/冷却旋管-
凝胶容量
18.3 x 19.3 厘米- 1 块凝胶（2 块凝胶堆叠）16 x 20 厘米- 1 块凝胶（2块凝胶堆叠）16 x 16 厘米-
13.3 x 8.7 厘米- 3 个凝胶并列
8.3 x 7.3 厘米每个凝胶夹1块凝胶共2个
凝胶夹（两种尺寸）4个凝胶并列
8.6 x 6.8 厘米
通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD 以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所需要转印的蛋白分子量差得比较多（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。
而对于半干转，我们一般选择恒流（膜面积的3倍：3 mA/cm2）之间一般60分钟，同样根据蛋白分子量适当调节时间。
需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用
丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。
具体的对于电压/电流的选择，可以参照下表。但合适的电转条件需要根据凝胶的厚度、膜的种类、蛋白分子量、电转缓冲液选择最优化的方案。
SDS-PAGE Gels (Towbin Buffer)
低强度高强度
Mini Trans-Blot槽30 V/90 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 60 min
Trans-Blot半干转印系统转印槽N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min Isoelectric Focusing Gels, Native Gels, Basic Proteins, and Acid-Urea Gels (0.7% acetic acid)
低强度高强度
Mini Trans-Blot槽30 V/10 mA, 16 hr 100 V/350 mA, 1 hr
Trans-Blot半干转印系统转印槽N/A Mini gels: 10–15 V/5.5 mA/cm2, 10–30 min
Large gels: 15–25 V/3 mA/cm2, 30–60 min
