实验五色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的紫外吸收光谱分析
一、实验目的
1. 掌握紫外-可见分光光度计的工作原理和基本操作。
2. 掌握紫外-可见吸收光谱的绘制（包括导数光谱）以及定量测定方法。
3. 掌握。
4. 了解氨基酸类物质的紫外吸收光谱特点。
二、实验原理
1. 紫外-可见吸收光谱法测定蛋白质含量的基本原理
紫外-可见吸收光谱法是根据溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法，也称作紫外和可见吸收广度法，它包括比色分析法和紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法属于吸收光谱法，分子中的电子总是处在某一种运动状态中，每一种状态都具有一定的能量，属于一定的能级。电子由于受到光、热、电等的激发，从一个能级转移到另一个能级，称为跃迁。当这些电子吸收了外来辐射的能量，就从一个能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。
图1 电子跃迁示意图
物质对不同波长的光线具有不同的吸收能力，如果改变通过某一吸收物质的入射光的波长，并纪录该物质在每一波长处的吸光度(A),然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，这样得到的谱图为该物质的吸收光谱或吸收曲线。
当一定波长的光通过某物质的溶液时，入射光强度I。与透过光强度I之比的对数与该物质的浓度c及样品池厚度b成正比。其数学表达式为:
此式为Lambert-Beer定律，是分光光度法定量分析的基础，其中A为吸光度。
由于不同物质具有不同的分子结构，对不同波长的光会产生选择性吸收，具有不同的吸收光谱，因而，我们可以利用紫外-可见吸收光谱法对物质结构进
行鉴定和进行定量分析、根据被测量物质分子对紫外-可见波段范围
(150~800nm)单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析
的一种方法。
氨基酸(amino acid)：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称，是蛋白质的
基本组成单位。氨基酸类物质的一个重要光学性质是对光有吸收作用。20种氨
基酸在可见光区域均无光吸收，在远紫外区均有光吸收，而在近紫外区(220
nm-300nm)只有三种AA有光吸收能力，这三种氨基酸分别是色氨酸(Try)、酪
氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)因为它们的结构均含有芳香共轭π键系统。苯丙氨酸
最大吸收波长在259 nm、酪氨酸在278 nm、色氨酸在279 nm,蛋白质一般都
含有这三种氨基酸残基，所以其最大光吸收在大约280 nm波长处，故我们能
够利用紫外-可见分光光度法很方便的测定蛋白质的含量。
图2 色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸结构式
2. 紫外-可见分光光度计基本构造
荧光分光光度计主要有五部分组成：光源、单色器、样品室、检测器、信号处理和读出装置。
(1) 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区: 钨灯作为光源，其辐射波长范围在320-2500nm。紫外区:氢、氘灯，发射185~400 nm的连续光谱。
(2) 单色器
从连续光谱中获得所需单色光的装置。
①入射狭缝: 光源的光由此进入单色器;
②准光装置: 透镜或返射镜使入射光成为平行光束;
③色散元件: 将复合光分解成单色光; 棱镜或光棚;
④聚焦装置: 透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝;
⑤出射狭缝。的单色光，作为激发光源，激发待测物质。
(3) 样品室
样品室放置各种类型的吸收池(比色皿)和相应的池架附件。
吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一一般用玻璃池。
(4) 检测器
利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。
(5) 信号处理和读出装置
与计算机连接，自动处理数据。
三、仪器试剂
1. 仪器：UV-2501PC Plus型荧光分光光度计，10 mL带玻璃塞的比色管，0.5mL、
1.0mL、
2.0mL移液管。
2. 试剂：
标准溶液(a)：100 mg/L酪氨酸标准溶液；
标准溶液(b)：100mg/L色氨酸标准溶液；
标准溶液(c)：1000mg/L苯丙氨酸标准溶液（所有溶液均用去离子水配制）；
待测样品：混合溶液。
四、实验步骤
1. 紫外-可见光谱溶液的配制
(1) 移取标准溶液(a) 2.0ml于10ml比色管中，稀释到刻度；
移取标准溶液(b) 1.0ml于10ml比色管中，稀释到刻度；
移取标准溶液(c) 1.0ml于10ml比色管中，稀释到刻度；
(2) 分别移取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml 标准溶液(b)于5个10ml比色管中，稀
释到刻度。
2.仪器操作
(1) 双击分光光度计图标“UVProbe”,出现软件界面，点左下角“连接”，系统开始
自检，等系统自检结束。预热15-30分钟。待仪器稳定后方可使用。
(2) 在光谱测量模式下，以去离子水为参比溶液，分别绘制步骤(1)中各溶液在
200~ 350nm波长范围内的吸收光谱。并记录各标准溶液的λmax。
·(3) 在定量测定模式下，以去离子水为参比溶液，测定步骤1.(2)中的各标准溶液在λmax处的吸光度。
(4) 在步骤(3)同样条件下，测定未知样品溶液在λmax处的吸光度。
(5) 对色氨酸、酪氨酸定性分析结果做1至4阶导数。
(6) 观察各阶导数光谱，选取酪氨酸导数光谱为0，且色氨酸导数光谱可取到
接近极大值的点。
(7) 在此波长上对各浓度色氨酸标准溶液进行求导测定，绘制标准曲线，计算
未知样品中色氨酸浓度。
五、数据处理
1. Phe、Tyr、Trp紫外-可见光谱定性分析
图3 氨基酸定性分析
