蛋白质分子基础5蛋白质一级结构测定

➢ 优点:不容易引起水解产物的消旋化。
➢ 缺点:Trp被沸酸完全破坏；
有-OH的Ser或Thr小部分被分解； Asn和Gln侧链的酰胺基→-COOH。 注:加入0.1-1%巯基乙醇和0.05-0.1%苯酚, Tyr或Thr 收率提高
❖第5页/共59页
蛋白质的水解
碱水解
➢ 5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 ➢ 缺点:
R1
N CS
C NH +
O CH
❖第18页/共R519页
NH2
O CH C R2
Edman反应
➢ 苯异硫氰酸酯（PITC）法：
多肽 or 蛋白质末端NH2＋PITC
↓
PTC－多肽 or 蛋白质
↓有机溶剂
┌－－－－－－N末端的PTC－AA发生环化
∣
生成苯乙内酰硫脲的衍生物
∣
↓
∣
脱离肽链
∣
除去N末端AA后剩下的肽链仍然是完整的。
➢ 分子量测定 ➢ 多肽链的组成，二硫键的断裂。
-SH，-S-S- + HCOOOH
➢ 蛋白质的氨基酸的组成。 ➢ 蛋白质的配基 ➢ 蛋白质的端基分析 ➢ 进行正常的序列测定****
❖第3页/共59页
-SO3H
蛋白质和肽的氨基酸组成
❖第4页/共59页
蛋白质的水解
酸水解
➢ 6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸,105-110℃ 水解20小时。
↓ （因为，PTC的引入，只使第一个肽键稳定性降低）
干燥
/∣\
薄层 气相 HPLC
层析 色谱
❖第19页/共59页
丹磺酰氯（DNS）法
❖第20页/共59页
封闭的N末端的测定
❖第21页/共59页
封闭的N端测序
❖ 末端为Gln的蛋白质发生环化反应，生成焦 谷氨酸酰基衍生物，此衍生物可用焦谷氨 酸特异性地裂解焦谷氨酰N末端，释放出 少一个Gln的肽。
蛋白质一级结构的测定
❖第1页/共59页
序列测定的基本方法学
➢ 将肽段用不同方法专一性地切断,将得到的 肽段分离纯化之后,分别测出各自的序列。 再将不同方法得到的序列进行比对，就可以 得到肽链的一级结构。
❖第2页/共59页
序列测定一般步骤
➢ 纯度要求:纯度在97%以上。
双向电泳；凝胶电泳；N-末端测定；纯化至恒定酶活； 肽谱分析。
水解过程中许多AA都受到不同程度的破坏，产率 不高。 水解产物发生消旋化。
➢ 优点:Trp在水解中不受破坏。
❖第6页/共59页
蛋白质的水解
磺酸水解
➢ 4mol/L甲基氨酸(含0.2%β-吲哚乙胺)色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。
➢ 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。
C末端氨基酸+ α－氨基醇 ↓
色谱法鉴定
❖第38页/共59页
羧肽酶法
➢ 羧肽酶法：
最有效，最常用的测C端殘基方法 性质：肽链外切酶，专一地从肽链的C端逐个降 解，释放出游离AA。
DTNB法(5.5’-二硫代双(-2-硝基苯甲酸)
Protein-Ｓ- +R-S-S-R(DTNB)
R
Protein-S-S-R+RS-
-
Protein-SH
Protein-S-S-Protein+RS-(CNT)
-COOH -NO2
反应产物(CNT)在412nm处可产生光吸收， 根据光吸收值可以相应地计算出巯基的含 量。
❖第31页/共59页
❖第32页/共59页
❖第33页/共59页
❖第34页/共59页
❖第35页/共59页
C末端分析
➢ a)肼解法 ➢ b)还原法：硼氢化锂还原剂 ➢ c)羧肽酶法（最有效、常用）
❖第36页/共59页
肼解法
❖
❖第37页/共59页
还原法
肽链C末端AA ↓硼氢化锂
α－氨基醇 ↓水解
H+ O2N
H2O
N-端氨基酸 RO
HN CH C OH
NO2 DNP-氨 基 酸 ❖第17页/共59页
NO2 DNP衍生物 + 氨基酸
Edman反应-PITC与多肽的反应
H
O
O
NC S
H N CH C NH CH C
R1
R2
H
N C S: O
O
HN CH C NH CH C
R1
R2
H
NC S NH C O CH
Trp ＝ (A288Tyr*1280) －(A280Tyr*385)
Tyr
(A280Trp*4815) －(A288Trp*5690)
➢ 对－二甲基氨基苯甲醛法
Trp在强酸条件下可与醛反应，产物在590nm下 有最大吸收。此吸收值与Trp含量成正比。可用 此法测量Trp含量。
❖第13页/共59页
巯基含量测定
➢ 缺点：
不容易彻底水解，也许回收率。 蛋白酶自身溶解的产物也会污染水解的氨基酸混合物。
❖第9页/共59页
氨基酸的分离与含量测定
❖第10页/共59页
❖第11页/共59页
特殊氨基酸的测定
❖第12页/共59页
色氨酸的测定
➢ 紫外吸收法 ➢ Trp与Tyr在280nm附近的光吸收成一定比
例，可用方程计算出Trp的含量：
❖第14页/共59页
末端氨基酸的测定
❖第15页/共59页
N-末端的测定
➢ sanger反应 ➢ Edman反应 ➢ 丹磺酰氯(DNS)法 ➢ 氨肽酶法
❖第16页/共59页
Sanger反应——2、4—二硝基氟苯（DNFB）反应
RO
RO
O2N
F + H2N CH C
O2N
HN CH C
NO2 DNFB
➢ 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破 坏。
➢ 优点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
❖第7页/共59页
蛋白质的水解
磺酸水解
➢ 4mol/L甲基氨酸(含0.2%β-吲哚乙胺)色氨酸可 回收90%以上,Ser与Thr的回收接近定量值。
➢ 用二硫苏糖醇还原胱氨酸，再用过量的连四硫酸 钠氧化，得到S-磺基半胱氨酸再测定。
➢ 缺点: 水解环境需中性，条件苛刻。 水解液中含较多碳水化合物时，色氨酸容易被破 坏。
➢ 源自文库点:中性水解液可以直接上机，色氨酸稳定。
❖第8页/共59页
蛋白质的水解
酶的水解 ➢ 选用专一性低、水解酶活力高的蛋白酶水解，可
以使蛋白质水解成游离的氨基酸。
➢ 优点：
其他水解不稳定的氨基酸，如Trp、Asn、Gln等，都可 以用此方法。
➢ 释放的肽可用Edman等方法等正常方法测 定。
➢ N端甲酰基可通过温和酸水解除去，活用 甲酰基酶除掉。 ❖第22页/共59页
❖第23页/共59页
❖第24页/共59页
❖第25页/共59页
❖第26页/共59页
❖第27页/共59页
❖第28页/共59页
❖第29页/共59页
❖第30页/共59页