免疫荧光通用操作规程
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免疫荧光通用操作规程
冰冻切片的免疫荧光
1,动物组织直接OCT包埋,或灌流后的组织30%蔗糖溶液4℃过夜后,OCT包埋。-20℃保存3月,-80℃长期保存。请勿保存于液氮。2,冰冻切片机切片至少10um,空气干燥2分钟后,-20℃储存
3,切片从-20取出后,在通风橱放10-30分钟以去除水汽,4%PFA 固定15分钟,或-20℃丙酮固定15分钟置通风橱2小时
4, 1XPBS清洗玻片,3X5min 从此请保持玻片湿润
5,有时,抗原修复3小时会得到更好的结果。为此请:选用稳定的抗原修复方式(真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热)…关注修复的温度,时间(抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间),抗原修复液必须遵循自然降温规律,使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液(A液枸盐酸缓冲液PH6.0,B液EDTA-Na缓冲液PH8.0,C液枸盐酸缓冲液PH4.5)
6,室温封闭1小时
封闭液:5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS
条件封闭液:1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS(细胞因子,无需封闭的蛋白
7,一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗
8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
9,二抗,1:1000 (alexa系列)1:300(dyelight )in封闭液,避光室温1小时
10, Wash,1XPBS, 3x5min
11, DAPI 染核5min,
12,DDW Rinse
13,抗淬灭剂封片,(避免气泡)避光置于通风橱过夜
14,干片后4℃保存
石蜡切片的免疫荧光
1,动物组织取出后经固定-脱水-包埋(见随后操作步骤),制成石蜡包块
2,组织学染色切片厚度2um,免疫荧光染色切片厚度至少6um,切片复水:58℃20min-
xylene 2x10min-
100%EtoH2x10min
95%EtoH2x10min-
70%EtoH10min-,DDW5min
4, Rinse 玻片1xPBS, 从此请保持玻片湿润
5,抗原修复过夜。为此请:选用稳定的抗原修复方式(真空负压.微波修复.高压修复.隔水加热.电炉加热)…关注修复的温度,时间(抗原修复时在有效的温度范围内所持续的时间),抗原修复液必须遵循自然降温规律,使用足量的抗原修复液…选择不同PH值的修复液(A液枸盐酸缓冲液PH6.0,B液EDTA-Na缓冲液PH8.0,C液枸盐酸缓冲液PH4.5)
6,室温封闭1小时
封闭液:5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS
条件封闭液:1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS(细胞因子,无需封闭的蛋白
7,一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗,如果没有二抗种属来源的正常血清,细胞因子用1%BSA封闭,同时一定要有一个阴性对照。
8, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
9,二抗,1:1000 (alexa系列)1:300(Dyelight )in封闭液,避光室温1小时
10, Wash,1XPBS, 3x5min
11, DDW Rinse , DAPI 染核5min,
12,DDW Rinse
13,抗淬灭剂封片,(避免气泡)避光置于通风橱过夜
14,干片后4℃保存
备注:多重荧光染色原则
A:尽量选择不同种属来源的一抗:可同时染
B:如果种属来源相同的一抗:可顺次染色,
抗原修复: O/N
第一个一抗:4℃O/N , 第二天对应二抗@RT 1hr 红光
短暂地封闭
第二个一抗:@RT 2hr,对应二抗@RT 1hr 绿光
:
DAPI
封片
备注:对照实验
A:阴性对照:组织免疫荧光必做
相同标本:只加荧光二抗:排除非特异性染色
不同样本:采用确定不含一抗对应抗原的标本验证荧光信号的特异性B:阳性对照:采用确定含有一抗对应抗原的标本
TUNEL与免疫荧光共染时
细胞的免疫荧光
1,细胞生长贴壁到80%融合,倒掉细胞培养液
2,Rinse,用固定剂rinse一到两次
3,首选4%多聚甲醛固定15min ,0.2%TritonX-100 打孔5-10min;或者选用不同的固定方式:
甲醇(分析纯or HPLC)-20℃10min
丙酮(HPLC)-20℃10min
4%多聚甲醛+0.2%TritonX-100 10min
4%多聚甲醛+0.2%Saponins10min 细胞核核膜
4%多聚甲醛15min + -20℃甲醇5min 细胞膜
4%多聚甲醛15min + -20℃丙酮5min 细胞骨架/微管蛋白
4%多聚甲醛10min @RT+4 ℃10min+ -20℃甲醇1min 细胞膜+胞浆蛋白+细胞核
4, Wash,1xPBS,2x1min 从此请保持细胞湿润
5, 室温封闭1小时
封闭液:5%BSA+10%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS
条件封闭液:1%BSA+3%二抗种属来源的正常血清in 1xPBS 6,一抗4℃过夜
请用封闭液稀释一抗
7, 第二天Wash,1XPBS, 2x1min
8,二抗,1:1000 (alexa系列)1:300(Dyelight )in封闭液,避光室温1小时
9, Wash,1XPBS, 3x5min, DDW Rinse
10, DAPI 染核5min,
11,DDW Rinse
12,抗淬灭剂封片,(避免气泡)避光置于通风橱过夜
13,干片后4℃保存