碱性磷酸酶显色剂使用方法

5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate (5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐), BCIP/NBT （四唑硝基蓝）是碱性磷酸酶底物, 产物为深蓝色, 在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP被水解, 水解产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

使用方法1. 在膜或组织切片，最后一次洗涤完毕后，加入适量BCIP/NBT染色工作液2. 室温避光孵育5-30分钟或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深度.3. 用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应4. 膜标本可干燥后避光保存；组织切片或细胞样品，显色反应终止后，可以用中性红复染染色干细胞成骨诱导的常用染色方法有几种碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。

成骨细胞染色方法以ALP为目标物的检测方法：1 Gomori钙钴法【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。

【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml2%巴比妥钠5ml蒸馏水10ml2% CaCl2 10ml2% MgSO4 1ml【步骤】（1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。

（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。

（3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。

自来水冲洗数次。

（4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。

（5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。

【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。

2偶氮偶联法：【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mgDMSO 0.5ml0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml六偶氮副品红0.5ml1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。

磷酸酶磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。

试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用；某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。

土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况）。

基本原理：土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。

应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。

当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。

因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。

这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。

该法可用于测定各种磷酸酶的活性：碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液），中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液），酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液）试剂配制：1）甲苯2）0.5% 磷酸苯二钠3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0）：称取12.404g硼酸（H3BO3）溶于700ml 去离子水，用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂：取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。

保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

5）标准溶液：（a）母液：1g酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中；（b）工作液：10ml溶液（a）稀释至1000ml（1ml含10ug酚）6）0.3%硫酸铝溶液标准曲线绘制：取0，1，3，5，7，9，11和13ml酚工作液（b），置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。

以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。

操作步骤：1）取5g风干土置于200ml三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠3）将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。

仅供科研版本号：180402 碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法)【产品组成】【保存条件】4℃,避光,3个月【产品概述】碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。

此酶主要存在于物质交换活跃之处（细胞膜），如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮。

此酶还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜及吞饮小泡。

碱性磷酸酶染色液(改良Gomori钙钴法)采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性。

此法以天然存在的β-甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，磷酸根与钙离子结合为磷酸钙沉淀，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色硫化钴沉淀。

【使用方法】(一)石蜡切片染色1、石蜡切片脱蜡至蒸馏水。

2、切片入ALP孵育液中，37℃孵育2~12h。

3、流水洗2min，入蒸馏水。

4、入硝酸钴溶液中，37℃孵育5min。

5、流水洗5min后，入蒸馏水。

6、在上述过程中配制ALP硫化工作液，即取试剂(C)用蒸馏水稀释50倍,即为ALP硫化工作液，即配即用。

切片入硫化工作液，孵育2min。

7、流水洗10min，入蒸馏水。

8、(可选)核固红复染细胞核，蒸馏水洗。

9、石蜡切片常规脱水、透明，树胶封片。

(二)冰冻切片染色1、冰冻切片在丙酮-氯仿等量混合液内，4℃固定2~5min。

2、切片入ALP孵育液，37℃孵育5~15min。

3、流水洗2min，入蒸馏水。

4、入硝酸钴溶液，37℃孵育5min。

南京森贝伽生物科技有限公司网址：/第1页5、流水洗5min后，入蒸馏水。

6、在上述过程中配制ALP硫化工作液，即取试剂(C)用蒸馏水或者去离子水稀释50倍,即为ALP硫化工作液，即配即用。

切片入ALP硫化工作液，孵育1～2min。

组织及血液碱性磷酸酶（AKP/ALP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：UPLC-MS-4426规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称规格保存条件提取液液体30mL×1瓶4℃保存试剂一液体10mL×1瓶4℃保存试剂二液体10mL×1瓶4℃保存试剂三液体30mL×1瓶4℃保存标准液液体1mL×1支4℃保存溶液的配制：1、标准液：10μmol/mL酚标准液，临用前蒸馏水稀释至2.5μmol/mL备用。

产品说明：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。

AKP/ALP广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。

在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）称取约0.1g组织，加提取液1mL充分研磨，4℃，10000rpm离心10min，取上清液待测。

血液可直接用于测定，或者适当稀释后用于测定。

二、操作步骤1、可见分光光度计预热30min以上，调节波长到510nm，蒸馏水调零。

2、操作表试剂名称（μL）测定管对照管空白管标准管蒸馏水--20-标准品---20上清液20---试剂一200200200200试剂二200200200200混匀后置于37℃水浴中保温15min试剂三600600600600上清液-20--混匀后于510nm测定吸光度，分别记为A测定管、A对照管、A空白管、A标准管。

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)使用说明自备材料：1、载玻片、湿盒2、普通光学显微镜产品简介：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。

此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。

碱性磷酸酶染色液(偶氮偶联法)不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法(又称同时偶联法)，其原理是在pH9.2～9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI磷酸盐水解，释放出磷酸不萘酚，后者不偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。

该染液可用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色，碱性磷酸酶活性部位呈蓝色，位于胞桨，结果较金属盐沉淀法可靠。

操作步骤(仅供参考)：一、涂片或切片1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蜡切片无需固定)，水洗。

2、滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，水洗。

3、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。

4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。

二、贴壁培养细胞1、取6孔板或其他容器培养的细胞，弃液，PBS清洗干净。

2、加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。

3、滴加配制好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15～20min，PBS清洗。

4、入核固红染色液或甲基绿染色液复染3～5min。

5、PBS清洗、镜检。

注意事项：1、血液或骨髓细胞涂片或其他样本均应新鲜，薄厚适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。

2、培养细胞染色操作过程中，清洗、染色等步骤都应轻微，以免损伤或丢失细胞。

碱性磷酸酶一、钙-钴法光镜显示方法（1）孵育液的配制：3％β-甘油磷酸钠 10ml （底物）2％巴比妥钠 10ml （缓冲液）2％氯化钙 20ml （捕获剂）5％硫酸镁 5ml （激活剂）双蒸水（D.W） 5ml孵育液最终pH值9.4，置于冰箱保存。

（2）操作步骤：①新鲜组织，作冰冻切片（可用10％福尔马林固定10min，或不固定）；②入孵育液，恒温37℃孵育 30～60min （磷酸钙沉淀形成）③流水冲洗 5min④置2％硝酸钴内 2min （磷酸钴形成）⑤蒸馏水冲洗；⑥置1％硫化铵溶液内 1min （硫化钴形成，脂溶性沉淀）⑦蒸馏水冲洗甘油明胶封固。

（3）结果与评价:碱性磷酸酶活性产物为棕黑色硫化钴沉淀。

（4）对照：从孵育液中去除底物或用左旋咪唑等抑制剂的方法，则酶活性反应为阴性。

二、偶氮-偶联法光镜显示方法（1）孵育液的配制：萘酚AS（或萘酚AS-MX） 10～25mg（底物）溶于N，N-二甲基甲酰胺液 0.5ml（促溶剂）0.2mol/L Tris盐酸缓冲液（pH9.2） 50ml（缓冲液）坚牢蓝B（或BB，RR，或坚牢红TR或坚牢蓝VRT） 50mg（捕获剂）（以上尽可能混合和过滤，必要时可用氢氧化钠调整pH9.0～9.2值）。

（2）操作步骤：①新鲜组织，作冰冻切片；②入孵育液，恒温37℃（或室温下）孵育5～60min （有色沉淀形成）③双蒸馏水冲洗 3～5min④4％甲醛，室温下固定 10～50min⑤蒸馏水冲洗 3～5min⑥甘油明胶封固。

（脂溶性沉淀）（3）结果与评价：采用不同的重氮盐，酶的活性显色也不同，用坚牢蓝B（或BB，RR）酶活性呈蓝色-紫色，用坚牢红TR (或坚牢紫B）酶活性呈红色。

仅供科研使用版本号：180718BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒【产品组成】【保存条件】4℃,避光,12个月。

【产品概述】BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit)是一种用于免疫组化显色、Western等膜显色和诱导多功能干细胞iPS鉴定等的试剂盒。

BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物，在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。

BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit可用于细胞或组织的碱性磷酸酯酶显色包括诱导多功能干细胞iPS的鉴定，也可用于Western等结合有碱性磷酸酯酶的膜的显色检测\细胞或组织内源性的碱性磷酸酯酶显色。

【使用方法】1、对于组织切片或细胞样品或膜，在与碱性磷酸酯酶标记的抗体或其它形式的探针孵育后，用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

2、对于检测内源性碱性磷酸酯酶的组织或细胞样品，在适当固定后，也用适当洗涤液洗涤3～5次，每次3～5min。

3、按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成BCIP/NBT染色工作液：4、洗涤完毕后，去除洗涤液。

5、加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。

5、室温避光孵育5～30min或更长时间(可长达24小时)，直至显色至预期深浅。

6、去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1～2次即可终止显色反应。

7、对于组织切片或细胞样品，显色反应终止后，如有必要可以用中性红染色液(neutral red stainingsolution)染色，以便于观察。

对于膜，显色反应终止后，可以室温晾干避光保存。

【注意事项】1、BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。

PH0405|BCIP/NBT即用型显色试剂盒Ready-to-use BCIP/NBT Solution,PremixedCatalog No：PH0405Size：☐100mL Store at2~8℃简介BCIP(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐＋NBT(四唑硝基蓝)是碱性磷酸酶（AP）最佳的底物组合之一。

在碱性磷酸酶的催化下，BCIP会被水解而产生强反应性的产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色化合物。

该试剂盒可用于AP系统的IHC和Western Blot实验的酶促显色。

在AP催化下，在组织切片或印迹膜上结合了AP偶联物的地方产生深蓝色沉淀，可根据颜色反应来确定目的蛋白的位置及表达情况。

本染色液为即用型工作液，可以直接使用，不用稀释。

使用参考1.印迹膜显色：将本品滴加在待检测的印迹膜上（或将印迹膜浸入到BCIP/NBT显色液中），室温避光孵育10-20分钟。

显色完毕后，将膜浸入水中，终止反应。

注：印迹膜显色前要用1×TBST漂洗3次，每次10分钟。

不要用1×PBST漂洗，因为无机磷是AP的强烈抑制剂。

2.组织切片或细胞爬片显色：滴加适量的BCIP/NBT显色液于需要显色的组织切片或细胞爬片上，室温避光孵育10-20分钟。

显微镜下观察控制显色时间，当达到最佳显色效果后，自来水冲洗终止显色。

显色后的切片经复染、脱水透明，封片后可长期保存。

注意事项1）BCIP对人体有刺激性，NBT对人体有害，请注意适当防护。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

冰冻切片组织碱性磷酸酶活性染色试剂盒产品说明书（中文版）主要用途冰冻切片组织碱性磷酸酶活性染色试剂是一种旨在使用偶联偶氮技术，在底物存在的情况下，分析组织样本中碱性磷酸酶表达，而呈现亮红色沉淀现象的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心改良、成功实验证明的。

主要适用于动物组织冰冻切片，同时也适合原生代或培养细胞的酶活性检测。

尤其可用于骨组织病理生理的研究和干细胞分化能力的鉴定。

产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，灵敏牢固，显色清晰。

技术背景碱性磷酸酶（ALKALINE PHOSPHATASE）在碱性环境下催化各种醇和酚的磷酸酯水解，存在于活跃运输的膜上，如毛细血管及毛细血管的动脉部分的内皮，肾近曲小管壁边缘和小肠上皮的纹状缘，胎盘组织，未分化的干细胞等表达含量最为丰富。

它与骨质的形成，维持细胞内磷酸酶的浓度，以及与经膜吸收和转运过程有关。

偶联偶氮技术的基本原理为碱性磷酸酶水解底物（磷酸萘酯）释放出萘酚，立即为重氮盐所捕获而成为不溶性有色的偶氮染料。

实验最初（1944）应用β-萘磷酸盐作为底物，释放出的萘酚与重氮α-萘胺偶联，在酶的活动处形成有色沉淀。

Burstone （1962）推荐使用替代萘酚，如萘酚AS-MX磷酸盐。

重氮盐有很多种，但较适宜的有Fast blue RR，Fast red TR，Fast violet B，Fast blue VRT 和Fast black B。

偶联偶氮技术孵育时间短；稳定，灵敏；在正常组织中因无萘酚，故不需要对照；反应产物为偶氮染料难以溶解，不易弥散因而图象清晰。

产品内容清理液（Reagent A）120毫升固着液（Reagent B）10毫升反应液（Reagent C）10毫升染色液（Reagent D）5管产品说明书1份保存方式保存在4℃冰箱里，避免光照，有效保证6月用户自备甲基绿复染试剂盒（HL40010）或苏木素复染试剂盒（HL80050）：用于常规染色后复染小型染色缸：用于染色操作光学显微镜：用于组织细胞染色后观察分析实验步骤样本染色操作开始前，将试剂盒里的反应液（Reagent C）和染色液（Reagent D）置于室温下预热，并避光。

碱性磷酸酶染色
1.量45毫升去离子水，调节温度至18–26°C
2.重氮盐溶液的制备：添加1毫升的亚硝酸钠溶液，在碱性溶液 1 mL FBB。

混匀2分钟。

3.添加制备步骤2到步骤1去离子水中的溶液.
4.添加1毫升萘酚AS-BI碱性溶液，稀释的重氮盐溶液（步骤3）。

拌匀后倒入一个染色缸。

5.把柠檬酸盐- 丙酮甲醛固定液至室温（18-26℃）。

样品浸入固定液30秒。

去离子水轻轻冲洗45秒。

不要让样品干燥。

6.添加碱性染料混合物（步骤4）和孵育18–26°C ,15分钟；避光；使用后丢弃碱性染料混合物
7.孵育箱温育15分钟后，取出去离子水冲洗2分钟。

不要让切片干燥。

8.中性红溶液染色2分钟。

9.自来水冲洗和自然彻底，镜下观察。

alp染色配制方法
标题，Alkaline Phosphatase (ALP)染色配制方法。

在生物医学研究中，Alkaline Phosphatase (ALP)染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中碱性磷酸酶的活性和分布。

下面将介绍一种常用的ALP染色配制方法，以供参考。

材料：
1. 磷酸盐缓冲液（PBS）。

2. 碱性磷酸酶染色液，主要成分包括碱性磷酸酶显色液和显微镜下检测所需的其他试剂。

步骤：
1. 准备组织切片，将需要染色的组织切片固定在载玻片上。

2. 脱脂，将载玻片浸入95%乙醇中脱脂，然后用蒸馏水洗涤。

3. 反应，将载玻片浸入碱性磷酸酶染色液中，在37°C下进行适当的反应时间。

4. 停止反应，用PBS洗涤载玻片，以停止染色反应。

5. 染色，将载玻片浸入碱性磷酸酶显色液中，进行适当的染色时间。

6. 清洗，用PBS洗涤载玻片，以去除多余的染色液。

7. 封片，将载玻片覆盖玻片封口剂，然后用封片机进行封片。

以上就是一种常用的ALP染色配制方法。

通过这种方法，可以清晰地观察组织中碱性磷酸酶的活性和分布情况，为生物医学研究提供重要的实验数据。

当然，不同的实验目的和样本类型可能需要适当调整染色条件，以获得最佳的实验结果。

碱性磷酸酶‎E L ISA‎方法实验原理：1. 在ELISA‎测定中，碱性磷酸酶‎的色原底物‎是对硝基苯‎磷酸盐(p-nitro‎p heny‎-phosa‎t e，pNPP)。

pNPP在‎碱性磷酸酶‎的作用下生‎成对硝基酚‎(pNP)，其在入＝405 nm处有最‎大吸收。

2. 由于较高浓‎度的无机磷‎可竞争性地‎抑制碱性磷‎酸酶的活性‎，所以用TB‎S体系，不能用含磷‎酸根丰富的‎P BS体系‎，否则会造成‎本底偏高。

3. 由于碱性条‎件下pNP‎的光吸收增‎强，并可使碱性‎磷酸酶失活‎，因而可使用‎氢氧化钠作‎为终止剂。

试剂：ELISA‎溶液体系：1XTBS‎1L体系H2O 定容至10‎00mlTris-HCl 6.06g 50mM 盐酸调PH 7.5 NaCl8.76g 150mM‎包被液：(pH9.6)。

过滤除菌，4℃贮存。

0.1M NaHCO‎3显色液：1. 0.1M glyci‎n e pH 10.4 + 1mM MgCl2‎+ 1mM ZnCl2‎配方：7.51g glyci‎n e + 203 mg MgCl2‎+ 136 mg ZnCl2‎+ 980 ml H2O，用浓NaO‎H溶液调至‎p H10.4，补水定容到‎1L。

2. 1 M dieth‎a nola‎m ine（二乙醇胺）pH 9.8+ 0.5mM MgCl2‎配方：97 ml of dieth‎a nola‎m ine +100 mg MgCl2‎+ 800 ml H2O，用浓HCl‎溶液调至p‎H9.8，补水定容到‎1L。

显色液中p‎N PP终浓‎度为1mg‎/ml。

终止液：配方：3M NaOH。

实验步骤：1. 包被：用包被液稀‎释靶分子，4℃过夜或者3‎7℃1h。

TBS洗3‎次。

2. 封闭：2%M-TBS 37℃1h。

TBS洗3‎次。

3. 结合：将表达菌用‎T B S重悬‎，超声后加入‎到孔中，37℃1h。

0.5%TBST洗‎3次。

碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)使用说明货号：BC1672有效期：6个月有效。

产品内容：产品名称50T100T保存试剂(A):ALP Assay buffer25mL50mL4℃避光试剂(B):ALP显色液25mL50mL-20℃避光试剂(C):显色基液75mL150mL-20℃避光试剂(D):Phenol标准(1mg/ml)1mL2mL RT试剂(E):ddH2O5mL10mL RT产品说明：碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP)为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适pH9.2~9.8。

此酶主要存在于物质交换活跃之处(细胞膜)，如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮之溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌的细胞膜。

碱性磷酸酶检测试剂盒(磷酸苯二钠比色法)(Alkaline Phosphatase Colorimetric Assay Kit)采用磷酸苯二钠比色法，其检测原理是磷酸苯二钠在碱性条件下，可在碱性磷酸酶的作用下生成游离酚和磷酸。

在碱性条件下酚与氨基安替比林结合，并经氧化生成红色醌式结构物，呈深浅不一的红色，产物红色越深，说明碱性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过酶标仪测定510nm处吸光度，据此通过比色分析就可以计算出碱性磷酸酶活性水平。

该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清等样品中内源性的碱性磷酸酯酶活性。

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

自备材料：1.离心管或小试管2.水浴锅或恒温箱3.比色杯4.分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、配制标准品工作液：取出Phenol标准(1mg/ml)恢复至室温后，取0.1ml溶解于1.9mlddH2O，使浓度达到0.05mg/ml，即为标准品工作液-Phenol(0.05mg/ml)。

人骨碱性磷酸酶(BALP)elisa试剂盒操作步骤检测范围：7μg/L -200μg/L使用目的：本试剂盒用于测定鸡血清、血浆及相关液体样本中皮质醇（Cortisol）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中鸡皮质醇（Cortisol）水平。

用纯化的鸡皮质醇（Cortisol）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入皮质醇（Cortisol），再与HRP标记的皮质醇（Cortisol）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的皮质醇（Cortisol）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中鸡皮质醇（Cortisol）浓度。

试剂盒组成标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

碱性磷酸酶标记试剂碱性磷酸酶标记试剂BCIP／T是碱性磷酸酶最常使用的呈色底物，碱性磷酸酶标记的试剂应该用真核生物的碱性磷酸酶，因为这种酶容易被EDTA灭活。

细菌酶难以终止其活性，易引起显色过度，导致较高背景。

BCIP／T底物在酶结合位点形成强烈的黑紫色沉淀，此反应是一个稳定进行的过程。

因此，可设定一个精确的反应对照。

可以通过孵育时间的长短控制反应的敏感性。

1．需要的溶液和特殊设备碱性磷酸酶缓冲液：100retool／L NaCl，5mmol／L MgCl2，100mmol／L Tris(pH 9．5)；T溶液(0．5gT用10ml 70％DMF溶解，贮存在4C)；BCIP溶液(0．5gBCIP[二钠盐]用10m1100％DMF溶解，贮存在413)；20mmol／LEDTA用溶解，DPX。

光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)2．操作步骤(1)细胞染色前，准备3种贮存液：①T：用10ml 70％DMF溶解0．5gT；②BCIP：用1 0ml 100％DMF溶解0．5g BCIP[二钠盐儿③碱性磷酸酶缓冲液：100mmol／LNaCl，5 mmol／LMgCl2，100mmol／LTris(pH 9．5)。

所有的贮存液置4C可保存1年。

(2)实验前，底物液新鲜配制。

加66／ul T贮存液至10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混合，加33ul BCIP贮存液，在1h内使用。

(3)将洗涤过的标本片放在一个适当的容器内。

加足够量的底物液覆盖标本片(3～5 ml适合于100mm平皿)。

在室温中进行反应直到染色达到适当黑色。

对一些试剂可在显微镜下定期监测。

一般孵育时间大约是30min。

(4)在含有20mmol／LEDTA的中漂洗以终止反应，螯合Mg2+。

(5)优化：如果需要，进行复染。

(6)用水冲洗，DPX封片。

【注意事项】大家在用药的时候，药物说明书里面有三种标识，一般要注意一下：1.第一种就是禁用，就是绝对禁止使用。

碱性磷酸酶染色液（偶氮偶联法）使用说明产品简介：碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，简称ALP或AKP）为一类磷酸酯酶，广泛分布于哺乳动物组织内，其活性所需最适PH9.2-9.8。

此酶主要存在于物质交换活跃之处（细胞膜），如肠上皮和肾近曲小管的刷状缘、附睾上皮之静纤毛、肝的毛细胆管膜以及微动脉和毛细血管动脉部之内皮，还见于内质网、高尔基复合体、吞饮小泡、肠上皮至溶酶体、中性粒细胞之中性颗粒以及平滑肌之细胞膜。

碱性磷酸酶染色液（偶氮偶联法）不是采用金属沉淀法来显示碱性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶联法（又称同时偶联法），其原理是在PH9.2-9.8的碱性条件下，细胞内碱性磷酸酶可使AB-BI磷酸盐水解，释放出磷酸和萘酚，后者与偶联重氮盐生成有色产物，定位于细胞质中。

该染液专门用于血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、梯度入水后的石蜡切片等的碱性磷酸酶染色，碱性磷酸酶活性部位呈红色，位于胞浆，结果较金属盐沉淀法可靠。

产品组成：自备材料：1、载玻片、湿盒2、普通光学显微镜操作步骤（仅供参考）：1、血液、骨髓或细胞涂片、冰冻切片、石蜡切片入ALP固定液固定3min（梯度入水后的石蜡切片无固定），水洗。

2、滴加配置好的ALP孵育液，放入湿盒中，避光孵育15-20min，水洗。

3、苏木素染色液复染5-8min或甲基绿染色液复染3-5min。

4、水洗、镜检或甘油明胶封固后镜检。

染色结果：普通光学显微镜:ALP活性部位红色细胞核蓝色（苏木素）或绿色（甲基绿）血液、骨髓涂片结果判断：细胞分值染色特点0无颗粒1稍有颗粒2中等程度颗粒3多数颗粒4充满颗粒临床意义：1、类白血病反应积分明显增高，未经治疗的慢性粒细胞白血病积分明显减低。

2、急性细菌性感染积分明显增高，病毒性感染积分多正常或减低。

3、再生障碍性贫血积分常增高，PNH、MDS积分常减低。

注意事项：1、血液或骨髓细胞涂片或其他样本均应新鲜，厚薄适宜，及时固定，否则会影响酶的活性。

碱性磷酸酶标记方法(戊二醛两部法)将100uL碱性磷酸酯酶加入到300uL10mM PBS（pH7.2），再加入40uL 25%的戊二醛，混匀，4摄氏度活化20小时；透析至10mM PBS（pH7.2），24小时，换液4次；将目的蛋白用10mM PBS（pH7.2）配成4mg/mL；将125uL目的蛋白加入活化过的碱性磷酸酶中（终浓度为5000U AP/mg蛋白），混匀，4摄氏度反应24小时。

参考文献：A蛋白碱性磷酸醋酶的标记及酶联测试Enzyme Linked Immunosorbent Assay Using Alkaline Phosphatase Conjugated withStreptococcal Protein G 使用200mgAP/mg 蛋白2.5mg AP（50IU/mg），加入200uL含1.25%戊二醛的100mM 的PB（pH6.8），混匀，室温反应过夜；4摄氏度条件下，电磁搅动，透析至50mM PBS（pH7.2），12小时，换液4次；1.5mg目的蛋白溶于100uL 1M的CB（pH9.5）；将活化的AP加入配好的蛋白质液体中，混匀，4摄氏度条件下反应24小时；加入10uL 200mM的赖氨酸溶液，混匀，22摄氏度条件下反应2小时；4摄氏度条件下透析至50mM PBS（pH7.2），12小时，换液4次；离心，取上清，用50mM TB7.4+0.6% BSA+0.05% NaN3稀释10倍，-20摄氏度保存。

底物缓冲液：100mM TB9.0+100mM NaCl+1mM MgCl2参考文献：碱性磷酸酶标记链霉亲和素2．戊二醛交联标记法：此法是以双功能交联剂为桥，使酶与抗体(抗原)结合。

最常用的交联剂是戊二醛。

它具有两个活性醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。

戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。

一步法将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时混合。

此法操作简便，广泛用于；HRP、AP与抗体(抗原)的交联。