大鼠灌注固定取脑,解剖取材

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从小脑处将脑组织向上推起，用小 剪刀剪断脑神经
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注意事项 1.多聚甲醛气味刺激，配臵时做好自我保护。
2.暴露心脏这一步骤，容易损伤肺、心脏或者肝脏，“夹持剑突并向上提拉，用弯 剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸”，人工气胸后，肺萎缩，胸腔 里的空间增大，提拉剑突后，不容易损伤肺、心及肝脏，出血少。
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省时省剂的方法 夹闭腹主动脉：只灌注上肢及头脑，固定 的好又快，又省试剂。先灌注生理盐水 约100ml， 见到老鼠两前肢及两肺变白即可改灌注多聚甲醛。多聚甲醛 用100ml以下即可。 灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠前肢剧烈抽动（下肢不 抽动证明腹主动脉夹闭完全）；前肢及颈部僵硬；所灌注的 脑组 织白而硬
大鼠灌注固定取脑
主讲：陈爽 2017.9.12
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用途
1.用于常规HE染色，免疫组化分析。 2.冰冻切片可以不做脑组织固定。
3.不可用于western blot和PCR。
4.如果观察脑组织的缺血、损伤或其它病变时，不作灌注 固定，而是在取出脑组织后作固定，将大大影响效果。
原理 心脏灌流术能够快速冲净血液并在动物死 亡前进行组 织的前固定,避免了组织的自溶 现象,是脑组织切片观察的 常用方法。多聚 甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的 原位和表面结构不变，从而能使其对应的抗体，准确检测 其表达的位臵和量。
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1.多聚甲醛的配臵： 一般方法为：4％多聚甲醛PBS缓冲液配法：称取40g PFA溶于装 有500mlDEPC水的玻璃容器烧杯或烧瓶）中，持续加热磁力搅 拌至60～65℃，使成乳白色悬液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4， 使呈清亮状（滴加），再加入约500ml PBS，充分混匀（在冰浴 或冷水浴中），可再检测一下pH，过滤后定容至1000ml，室温 或4℃保存备用。
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大鼠脑组织取材步骤
1.剪开皮肤
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2.用钩镊再眼眶处固定大鼠颅骨，用组织剪再颅骨和颈椎 连接处剪断
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3.组织剪头部伸入枕骨大孔，尽量贴着骨头（不能插太深伤到脑组织）。
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4.组织剪从枕骨大孔处伸入，朝向同侧眼眶方向，贴着骨 头剪，剪到眼眶
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5.从大鼠眼眶之间剪断
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6.左手持钩镊插入大鼠的眼眶固定颅 骨，用弯钳直接夹住枕骨大孔处的骨 头直接就掀起来了
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常见问题
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1.灌注取脑不可用于Western blot及PCR的原因
多聚甲醛使组织蛋白发生交联，以保持蛋白的原位和表面结构不 变，从而能使其对应的抗体，准确检测其表达的位臵和量。 Western中，要用去污剂使各种蛋白发生变性、解聚，并变成统一 的线性肽链，从而能够用凝胶电泳进行分子量的梯度分离。多聚 甲醛会影响蛋白的解聚，从而使其无法用凝胶分离。 另外，WB和 免疫组化所使用抗体的抗原表位也不同，WB的抗体一般识别蛋白 的一级结构，所以可能也无法识别甲醛处理的蛋白。 PCR要提RNA，RNA非常容易降解，必须新鲜取组织，然后尽快超 低温冷藏或者马上抽提，否则非常容易降解。灌注固定的组织， 原则上是能够提得出DNA和RNA的，但是肯定会有较多的降解， 一般不会这样做。
3.经心脏灌注，有时穿刺针会误进右心室，那样灌注主要在肺循环起作用，体循环 的血液影响不大。所以观察将穿刺针插入到主动脉内可以确保起到体循环灌注冲洗 血液的效果，脑组织的血液冲干净后，才不会影响免疫组化的效果，不然到处都是 红细胞造成的背景染色。 4.灌注时注意排空输液管中的气泡，不然容易气栓，影响灌注效果。一定要看到大 鼠较剧烈抽搐，不然证明灌注不好。
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2.制作灌注装臵，用两瓶塑料包装的输液瓶装灌注液。同时配好输液器备用。 3.10％水合氯醛按4mL/100g的剂量腹腔注射麻醉动物。 4.沿两侧肋弓剪开皮肤，打开腹腔，用止血管钳夹持剑突并向上提拉，用弯 剪在膈肌与胸骨柄相连处剪一小口，造成人工气胸，然后向两侧顺延，剪断 膈肌及肋骨，夹持剑突的血管钳将剑突连带胸廓上翻固定，充分暴露心脏， 直视下穿刺针左心室心尖处，用血管钳固定。 5.快速滴注生理盐水(室温)，同时剪开右心耳。约注入100~150mL，至流出液 体血色较浅基本澄清，停止灌注。肝脏、眼珠、爪子迅速变白是排出血液的 有效观察指标。 6.继续用4%多聚甲醛灌流250ml固定。 7.后固定：灌流后的脑组织臵于4％PFA臵4度冰箱内进行后固定，时间>2h， 过夜最好
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5.关于生理盐水的温度的选择，有人认为因为是快速冲刷 血管里的血液，低温造成血管收缩，灌注的效果反而没有 室温的好。但是用低温的认为，低温有利于组织完整。 6.灌注成功的标志：刚开始灌注时老鼠剧烈抽动；成功后 老鼠后肢绷直，尾部竖起成一直线；所灌注的脑组织白而 硬。
7.去颅骨后脑表面有一层硬脑膜,要去掉。
简便方法：先配好PBS，称好相应的多聚wenku.baidu.com醛，37℃水浴或温箱 密封放臵2天，就能全溶。若是很急，55℃水浴一天，期间不时 震荡。注意，4%的多聚甲醛需临用前配制,配制后需过滤去除小的杂质,避免心脏灌 流时造成栓塞影响灌流效果。 也可用10%福尔马林溶液，甲醛1：10稀释 甲醛100ml 磷酸二氢钠4g 磷酸氢二钠6.5g 或甲醛100ml加900mlPBS缓冲液。 蒸馏水900ml
取脑
保存或切片.
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具体过程 大鼠经深度麻醉后，固定于自制的手术木板臵于解剖盘中, 开胸暴露并游离出心脏,经左心室插入灌流针并固定, 切开 右心耳,先灌注冰冻无菌生理盐水(4℃)XmL，直到肝和肺脏 颜色转白及右心房流出液澄清,后再灌注冰冻(4℃)4%多聚 甲醛XmL,断头取脑,多聚甲醛浸泡固定24小时。
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必要性
1.脑组织较软，且细胞成分不易保留，脑组织是较易软化的组织之一，血供
也较为丰富，所以最好是在取脑组织前用4％多聚甲醛灌注固。
2.经前固定后，取脑操作时，可减少脑组织损伤。
3.脑内血液都在，HE染色后，可去除红细胞背景影响
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流程 麻醉 开胸 心尖向左心室穿针
剪开右心耳
4%多基甲醛固定
生理盐水冲洗