转基因小鼠技术

转基因小鼠技术
---转基因小鼠的构建
李懿萍
2010.05.20
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基因打靶的简易程序
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胚胎干细胞（ES细胞）法
优点： 外源基因整合情况的可控性高 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、 表达的水平及插入的稳定性 外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛 选方便 缺点： ES细胞系建立及培养困难 维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易 所得个体为嵌合体
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小鼠的历史
6. 1909年 -- 实验鼠的诞生
Clarence Cook Little是一个来自于William Castle 实验室的哈佛大学生物学家，他培育 出了第一个近亲繁殖的小鼠株系――DBA。
7. 1916年 -- 肿瘤易受性和组织相容性
Clarence Little 和 Ernest Tyzzer 发现在同一株系小鼠间进行肿瘤移植不 会产生排斥现象，但不同株系间的移植则会发生排斥反应。 Jackson实验室的George Snell在1940年代发现了组织相容性基因---荣 获了1980年的诺贝尔奖
体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基 础理论和实验技术上还需进一步探索。
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5、精子载体法
将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能 力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植, 这样产生的动物也会使外源基因得到表达。 精子携带DNA的途径 外源DNA与精子共孵育 电穿孔导入法 脂质体转染法
鉴于基因的完整性,目的基因上下游的侧翼序列可以消除或 减弱基因整合的位置效率。
缺点：
不稳定，制备工艺繁琐。
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7、BAC法（人工细菌染色体法）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ建立在大肠杆菌的F因子上的BAC载体：外源DNA可>300kb。
F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。 100kb,近百个蛋白质。
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小鼠的历史
15. 1983年 -- PCR
Kary Mullis --1993年的诺贝尔奖
16. 1987-89年 -- 第一只基因敲除小鼠
Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的几 个研究小组--- 2001获得了Lasker奖
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小鼠的历史
8. 1921年 -- C57BL株系
基因组测序在2002年完成
9. 1929年 -- Jackson 实验室 ---世界上最重要的小鼠遗传学研究中心
在Hudson 汽车公司的头目Edsel Ford 和Roscoe Jackson两位大财主的资助下， Charence Little 在美国缅因州Bar Harbor 建立了Jackson 实验室
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3、逆转录病毒感染法
主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域 具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR 下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒, 去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基 因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。
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转基因动物生物反应器研制
转基因动物生物反应器概念：
将具某种重要应用价值的生物活性蛋白基因导入 动物受精卵或早期胚胎，培育转基因动物，使外 源基因在动物的特定组织内高效表达，再从这些 组织的分泌液、浸出液或血清中分离提取目的基 因产物。 乳腺---理想器官
肾脏和膀胱
多肽药物、蛋白质疫苗、酶类
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转基因小鼠技术
---转基因小鼠在科研中的应用
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小鼠的历史
1. 7500万－1.25亿年前 -- 人鼠始祖
2. 19世纪 -- 宠物鼠---实验鼠的“先驱”
3. 1897年 -- 重组表型
23. 2002年8月 -- 小鼠基因组物理图谱
24. 2002年12月 -- 小鼠基因组
小鼠基因组测序协会发表了一份高质量的小鼠基因组序列草图， 并且同时对C57BL/6J小鼠株系做了分析。这个基因组大小约为 2.5Gb，比人类基因组要小，预计的基因也少于30000个。约有 40%的小鼠和人类基因组序列相高度似性，80%的人类基因在小 鼠基因组中能找到相应的基因。同时还有不少文章对小鼠遗传组 成的其它方面做了详细讨论。在日本RIKEN 基因组科学实验室 的努力下，很多相关的重要资源都能够被免费获取。
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小鼠的历史
10. 1953年 -- DNA双螺旋
Crick，Watson和Wilkins三人因为这项 杰出的成就荣获了1962年的诺贝尔奖。
11. 1966年 -- 遗传密码破译
Robert Holly，Har Gobind Khorana 和 Marshall Nirenberg 破 译了遗传密码---1968年的诺贝尔奖
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3、逆转录病毒感染法
优点 由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的 高度整合特性, 大大提高基因转移的效率 细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中 扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体 缺点 获得纯合体的转基因动物的机会少 病毒载体构建复杂 转入的外源基因的大小受到限制, <10kb 转入病毒自身基因的复制表达
缺 点
精密仪器， 供体细胞易 技术操作较难，衰老 易造成宿主动 物基因组的插 入突变
有些结果 不能重复
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Electroporation
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20. 2001年2月 -- 人类基因组 21. 2001年6月 -- 散弹法
美国公司Celera Genomics 使用散弹法测得了 用于销售的小鼠序列草图。散弹法是一种一 次性测得基因组全序列的技术。
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小鼠的历史
22. 2002年5月 -- 16号染色体与已被分析的人类 21号染色体序列高度相似
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5、精子载体法
优点
基因转化方法简便,效率高
动物育种不经过嵌合体,实验周期短 缺点 目的基因整合的随机性 无法早期验证修饰事件 成功率不高、效果不稳定
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6、YAC法（人工酵母染色体法）
优点：
克隆百万碱基对(Mbp) 级的大片段外源DNA 的能力,可以保 证巨大基因的完整性; 保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变; 保证较长的外源基因片段在转基因动物研究中整合率的提高;
细菌-动物细胞-转基因动物
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转基因动物生物反应器研制
乳腺生物反应器具有以下特点： ⑴乳腺是自我封闭系统，乳腺表达的蛋白质不回流到血液循 环系统，避免外源基因表达的蛋白质对动物本身的影响； ⑵乳腺组织是一种有效的蛋白质合成器； 一头奶牛一年可生产乳蛋白250—300Kg，一只绵羊或山羊 一年可生产乳蛋白25—30Kg。如果有百分之一的乳蛋白代 换成医用蛋白，产量十分可观。 ⑶乳腺分泌的基因产物不但产量高，而且易提纯。表达的蛋 白经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。生物活性 接近天然产品； ⑷在动物乳腺表达的外源基因可以遗传，可用常规技术繁殖 生产群体。
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小鼠的历史
12. 1972年 --- 小鼠遗传学的计算机数据库
Jackson 实验室设计了第一个哺乳动物遗传学计算机数据库
13. 1977年 -- Sanger 测序法
和同事Walter Gilbert分享了1980年的诺贝尔化学奖---人类和小鼠基因 组测序过程中的主要技术
14. 1982年 -- 转基因小鼠
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4、体细胞核移植法
显微法和克隆法效率比较
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1997 Nature 385, 810–
4、体细胞核移植法
优点 减少受体动物的数目,不需要用受体母畜来承担那 些非转基因的胚胎,表现了强大的生命力。 事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛 选,简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力, 具有很大的优越性。 缺点
17. 1996年 -- “百慕大法则”
公共基因组序列数据
18. 1998年 -- 克隆鼠
1997年克隆羊“多莉”诞生之后，夏威夷的一个小组培育出 了第一批克隆鼠——“Cumulina”和她的姐妹们。
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小鼠的历史
19. 1999年 -- 小鼠基因组测序协会
人类基因组三个主要测序中心（The Wellcome Trust Sanger Institute, The Whitehead Center for Genome Research 和 Washington University Genome Sequencing Center）成立了一个相互协作的小鼠基因 组测序机构，取名为小鼠基因组测序协会（Mouse Genome Sequencing Consortium ,MGSC)
基因表达有时空与组织的特异性； 外源基因的表达受特异性有关顺式作用序列的调控；
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基因工程定向育种
向动物体转移外源基因并使之在动物体内表达， 能够克服物种间固有的生殖隔离，实现动物育种 之间遗传物质的交换。 实质是将基因转移与传统育种方法结合，各取其 精华，快速创造新的目的变异和固定扩展变异， 从而快速培育出高产优质和抗逆动物品种。 转基因羊、猪、鸡、鱼、鼠等
可构建BAC文库；
有单一的loxp位点，利于图谱分析（借助标记loxp和cre
重组酶；
BAC载体两端有Sp6和T7
引物序列利于测序，确定基因的
染色体定位； 可稳定遗传，易于操作。 BAC文库：基因组酶切后100～300kbDNA+BAC大肠杆菌
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基因转移方法的比较
方 法 优 点 显微注射 外源基因整合 效率较高，不 需要载体，目 的基因的长度 可达100Kb 核移植 转基因效率 高；预测基 因表达水平； 可以使用定 点整合技术 胚胎干细胞 外源DNA的 整合率高； 整合在生殖 细胞中的比 例也很高。 ES细胞株不 易建立，长 期培养后出 现分化现象； 生产的转基 因动物都是 嵌合体 逆转录病毒 可在整合点 整合转移基 因的单个拷 贝； 插入的基因 有大小限度； 嵌合性很高； 外源DNA 在 动物各种组 织中的分布 不均 应用 具有 一定 局限 性 基因 敲除 精子介导 该方法简 单、方便
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小鼠的历史
4. 1900年 -- 从宠物鼠到实验鼠
Abbie Lathrop----饲养宠物鼠 1902年，William Ernest Castle购买老鼠，用于遗传 学研究。哈佛大学---老鼠的毛色进行观察，以检测 孟德尔法则的正确性。
5. 1905年 -- 孟德尔老鼠
通过对黄白相间的杂色鼠进行研究，法国遗传学家 Lucien Claude Cué 发现，两个携带黄色皮毛基因 no 的老鼠之间交配，其子代老鼠中黄色老鼠和白色老 鼠的数量比总是2:1。--这是报道的第一个等位纯合 致死的基因。
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转基因小鼠技术的应用
基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究
基因工程定向育种
转基因动物生物反应器研制
人类疾病小鼠模型与基因治疗 药理学研究 器官移植 环境科学研究
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基因表达调控、基因功能及发育调控作用的研究
Hox gene(同源异形盒基因） 疾病基因 学习与记忆基因 生理周期基因
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4、体细胞核移植法
首先将目标基因转移到体外培育的动物体细胞中,筛选 出阳性转基因细胞并进行繁殖,制备出供移植用的细胞核 供体。然后将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞 中,重构胚胎经过激活和培养后,移植到代孕小鼠中 1997 年, 英国Roslin 研究所的Wilmut等利用成年绵 羊乳腺上皮细胞作为核供体,成功获得了体细胞克隆绵羊 多莉(Dolly) ,拉开了动物体细胞克隆技术的序幕。