人类外周血染色体标本制备及核型分析

20％
4％ 100单位/毫升 100单位/毫升
用 3.5%NaHCO3 调 pH 到 7.0-7.2 ，玻璃滤器抽滤灭菌。在超净工 作台，分装到培养瓶中（每瓶含培养基5毫升）。培养基置于-20℃ 冰箱保存。使用前从冰箱中取出，温育至37℃。
2、肝素（heparin ）：浓度0.2 ％，200 毫克肝素粉末溶于
二、实验原理
在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分 裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交 织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞 有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上， 此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期 的细胞来观察染色体的形态、数目。 在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色 体标本。但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处 在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。在细胞 培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可 以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再 通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。再通过离心、 低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。最后通过染 色就可以观察染色体的结构和数目。本方法已为临床医学、病 毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。
核型分析
染色体识别方法
• 染色体大小 • 着丝粒位置 • G分带带型
人类染色体大小
人类染色体着丝粒位置
人类染色体G分带
人类染色体核型分析例1：正常女性核型
核型分析2：异常染色体核型
三、实验步骤
1．先贴一张相片于报告纸 上方。 2．将另一相片上的染色体 逐个剪下，按丹佛和人类染色
分子医学实验
闫小毅 电话：88208257 E-Mail：yanxiaoyi@zju.edu.cn
人类外周血染色体标本制备 G带观察及核型分析
• 人类外周血染色体标本制备 • 染色体G带观察 • 染色体核型分析
人类外周血染色体标本制备
一、实验目的 熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。 初步掌握人类染色体标本培养和制备的基 本方法。
８、磷酸缓冲液(pH 6.8)
溶液A：磷酸二氢钾 (KH2PO4.2H2O) 9.078克溶于1000毫升蒸 馏水中。
溶液B：磷酸氢二钠 (Na2HPO4.2H2O) 11.876克溶于1000毫升 蒸馏水中。
100毫升缓冲液：需溶液Ａ50.8毫升，溶液Ｂ49.2毫升。
五、注意事项 1、采血接种培养时，注意加入适量的肝素。 2、培养基中不含 L-谷氨酰胺，则溶解有RPMI1640培养基 的液体可先用浓盐酸调 pH值等于4，然后高压灭菌（注意121℃， 15磅，灭菌15分钟）。冷却后，再加入L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、
人类染色体核型分析
一、实验目的
通过实验掌握染色体核型分析的常用方法以及G带的带型
特征和识别技巧，初步学会识别G带染色体。 二、实验原理 将一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来构成的图 像就称之为该细胞的核型(karyotype)。核型分析有多种方法， 如G带，R带、C带等。将染色体标本用显带方法处理后， 再用Giemsa染色，这类技术就称为G分带，通过显微摄影，
10、再固定，加入5mL固定液（甲醇：冰醋酸=1：3），室温固定
10-15分钟
11、再离心 1000转/分离心10分钟，弃去上清液。 12、再固定 加入固定液（甲醇：冰醋酸1：1）5mL,打匀， 固定 10－15分钟。 13、制片
固定后，1000转/分离心留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴
在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上 通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（air drying）。
8、培养失败的可能原因：
培养瓶等器材洗涤不合要求。
配制培养基溶液的二或三蒸水不合要求。 PHA和培养基存放时间过长。 无菌操作不符合要求，发生细菌污染。 9、标本质量不佳的原因： （1）秋水仙素处理不当。 （2）低渗处理不当，低渗时间的掌握与气温有关。
（3）离心速度不合适。
（4）固定不充分：如固定液不新鲜，染色体形象模糊，呈 毛刷状，染色体周围有胞浆背景。因此，固定液纯度要高， 临用时新鲜配制。
100毫升生理盐水中。高压灭菌，冰箱保存备用。
3 、 KCl ： 0.075M ， 0.559 克氯化钾溶于 100 毫升双蒸水中。
4 、秋水仙素： 10 微克 / 毫升，作为有丝分裂的阻止剂，
抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。称 10
毫克秋水仙素溶于100毫升生理盐水中，配成100微克/毫升的
人类染色体Ｇ带标本制备及观察
一、实验目的
通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下
直接观察G带分裂相。
二、实验原理
有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体
制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa染色。胰酶可以 从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。通过胰酶处理使Ｇ带区的 疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。由此可见在Ｇ带 区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。 关于显带机理有多种论点， 总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。
体遗传学命名的国际体制
（ISCN）排列编号。粘贴时短 臂向上，长臂向下。 3．在分析结果中，写出该 细胞的核型式，注明性染色体。
三、实验步骤
１、采血
２、培养 RPMI1640培养液，37℃0.5℃恒温中培养72小时。 3、秋水仙素(colchicine)处理 在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。 4、离心 以1000转/分离心10分钟，弃上清，留沉淀并用吸管打匀。
５、低渗处理 加８毫升预温(37℃)的0.075M KCl低渗液（hypotonic solution） ， 用吸管打匀使细胞 悬浮于低渗液中，37℃水浴箱静止25－30分钟。 6、预固定 低渗后，加新配的固定剂（甲醇：冰醋酸， 3:1 ）１毫升，打 匀。 7、离心 以1000 rpm离心10分钟，弃上清 8、固定 加入5ml新配置的固定液，悬浮细胞，室温固定10-15分钟 9、离心 1000rpm离心10分钟，弃上清
就可得到G带染色体的显微相片。
人类染色体分组
Group A Chromosome 1, 2 and 3 Group B Chromosome 4 and 5 Group C Chromosome 6 to 12 and the X Chromosome Group D Chromosome 13 to 15 ( the “large acrocentrics” satallited short arms )
原液，分装小瓶，高压灭菌，-20℃冰箱保存。临用时取上述 原液用生理盐水稀释成10微克/毫升。 5、 甲醇 （ methanol ） 6、 冰醋酸 （acetic glacid）
７、吉姆沙染液（Giemsa） 先将0.5克吉姆沙粉未干研磨，加33毫升60℃预热的纯甘 油，在研钵中研磨，在60℃水浴中保温90分钟。冷却后，再 加入33毫升甲醇，滤纸过滤，收集在棕色瓶中保存。原液要 提前半年配制。原液中按比例加入磷酸缓冲液即可染染色体 标本。 １份Giemsa原液＋９份磷酸缓冲液
养时间。培养液的最适pH7.2-7.4。pH偏酸，细胞发育不良，偏碱
细胞会出现轻度固缩。 5、PHA的质量和浓度是培养成败的关键问题。PHA如果保存 时间太长，效价会降低，应在培养基中多加一些。 6、培养过程中，如发现血样凝集可轻轻震荡，使凝集块散开，
继续培养。
7、最好使用水平式离心机，离心速度不易过高，否则沉降在 管底的细胞团不易打散；反之，离心速度太低，细胞会丢失。
PHA、灭活小牛血清和双抗。
3 、接种的血样愈新鲜愈好，最好在 24 小时内培养。如果
不能立刻培养，应置于4℃冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。
4、温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血中淋巴细胞 培养最适温度为37℃0.5℃，温度过高过低都将影响细胞的生长， 但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培
Group E Chromosome 16 to 18
Group F Chromosome 19 to 20 Group G Chromosome 21 and 22 ( the “small acrocentrics” satallited short arms ) and the Y Chromosome
14、染色（ Giemsa staining） Giemsa染液染色８分钟，玻片用自来水冲洗，晾干。 15、镜检（microscopic examination）
四、试剂和药品 1、 培养液的配制 RPMI1640培养基(含L-谷氨酰胺和碳酸氢钠) 80％
小牛血清(56℃水浴灭活30分钟)
植物血凝素PHA (主要成分是粘多糖和蛋白质) 青霉素终浓度 链霉素终浓度
三、药品和试剂
1、Hanks液：
NaCI KCI Na2HPO4.12H2O K2HPO4 葡萄糖 2.0克 0.1克 0.0375克 0.015克 0.25克
加双蒸水250毫升及１％酚红0.5毫升，成HanKs液。 2、胰酶液 称取胰酶0.2克溶于100ml HanKs液中，搅拌半小时，用１ＮNaOH调pH7.07.2，冷冻保存。（最好现配现用） ３、磷酸缓冲液 (pH6.8) 4、 Giemsa染液 ５、生理盐水
四、实验步骤
１、先将胰酶液水浴加热到37℃。
２、将染色体标本浸入胰酶液中，作用时间几秒到几十秒不 或37℃恒温老化3-7天)
等，依样本存放时间长短而定。(标本需预先经 60-70℃烤２小时，
３、取出玻片标本，在生理盐水中过一下，再经过蒸馏水洗。 ４、Giemsa 染色８分钟。 ５、自来水洗、晾干。 ６、镜检。在低倍镜下选择分散及显带良好的分裂相，然后 在油镜下观察。如观察到染色体变粗并显得毛糙边缘，有时甚至
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呈糊状，是处理过度了。
五、注意事项
1 、带效果的好坏，主要决定于染色体的标本质量。标本染色 体要长，染色体分散合适，背景无胞浆，标本未老化即保存时间过 长。 2 、要注意胰酶处理的温度和时间。稳定显带的条件，才能保
证显带效果。
3、磷酸缓冲液的pH值不要过碱，否则着色不鲜明。 4、G带制备有许多种方法，各个实验室在细节处理上均不同， 最好总结出适合自己实验室采用的方法。如果使用效果良好，不要 轻易更换新方法。