免疫胶体金标记手册

利用柠檬酸为还原剂，可以制备12～150nm直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时，胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时，建议使用该方法制备12-16nm直径的胶体金。
除了上述方法外，也可以用磷作为还原剂来制备5nm的胶体金，它避免了单宁酸残基的问题，但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒，制备的残液需进一步处理，故该方法已经很少使用。
(3)室温下轻轻摇匀15min，然后加热沸腾并保持5min，自然冷却。
3、柠檬酸三钠法制备12-30nm胶体金(Frens, 1973)
(1)取250ml三角瓶一个，加100ml双蒸水及1ml1%氯化金，加热沸腾；
(2) 取不同量的1%柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀，再保持沸腾30min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。
在确定最佳pH值后，最后要确定最小蛋白量，即能够形成稳定探针的蛋白的最小量。如果在制备探针时加入太多的蛋白，不仅造成浪费，而且更为严重的是容易造成探针凝聚，并严重影响标记活性。因为探针溶液中的游离蛋白容易抢先与标记位点结合，起到“封闭”（Blocking）作用，而胶体金探针标记不上。在标记位点希少、被标记物含量较少的情况下要特别注意。
注意：
1．如胶体金粒子直径较小（3～6nm），加NaCl需放置较长时间（几个甚至十几个小时）后才能观察到颜色变化。必要时可放大反应体积（1 ml胶体金），并借助离心来判断。
2．有些蛋白最佳pH范围较窄，设置的梯度不能太大。
5、最小蛋白浓度的确定
(1)用0.22m微孔滤膜过滤或高速离心去除蛋白中残物或多聚体；
其基本过程如下：
(1)用PBS（pH 7.0，含10 mM EDTA，20 mM盐酸半胱氨酸）溶解纯化的IgG
(2)加固化木瓜蛋白酶
(3)37℃处理5h
(4)离心，去除固Baidu Nhomakorabea木瓜蛋白酶（沉淀）
(5)过Protein G柱
(6)纯化的Fab片段按前文方法做进一步处理
注：Fab与胶体金结合的pH值为6.5
(2)取一50ml烧杯，加入4 ml 1％柠檬酸钠，然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的25mM K2CO3。预热至60～70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果单宁酸的量少于0.5ml时，对pH的影响不大，K2CO3可以省略。
(3)将上两种溶液迅速混合并充分混匀，加热至沸并保温10分钟。自然冷却。
二、蛋白-金复合体的制备
一般认为胶体金粒子表面为一层AuCl2，因此，粒子表面带有负电荷，这种负电荷粒子之间相互排斥，形成稳定悬浮的胶体金溶液。
金颗粒表面可以包被一层生物大分子（如蛋白）来稳定和保护这些粒子，以免受外来电解质的影响而相互凝聚在一起。胶体金粒子对蛋白的吸附作用取决于pH值，这是因蛋白的净电荷取决于溶液的pH值，在pH=pI时为中性。由于在pH=pI时蛋白溶解度最小，因此这时它水化程度最小，最溶液吸附到疏水的金粒子表面。但在实际的胶体金探针制备中，一般胶体金调整为pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。
浙江大学电子显微镜室浙江大学生物技术研究所
胶体金免疫标记技术培训班
技术资料
胡东维洪健徐颖
浙江大学
2001年10月
一、胶体金的制备
根据不同的制备方法，可以制备出直径1－500nm的胶体金粒子，但做为免疫标记探针，其直径应在3-30nm范围内。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。粒子直径每增加一倍，数量减少为原来的1/8。
(2)取一96孔滴定板，每个重复为若干个孔，分别加入最佳pH的胶体金100l，重复3次；
(3)各孔依次加入不同量的蛋白（一般浓度为0.05-0.1 mg/ml）1～20l，混匀，室温下放置15min；
(4)加入20l 10％NaCl，室温下放置10min；
(5)颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。
(4)分别加入12l 2%PEG20000，室温放置5 min；
氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1ml保存（-20℃）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1％双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。
(12)分装，即将使用时4℃保存，备用-20℃保存。
为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4℃下进行。对于冻干抗血清或长时间保存的血清，将生理盐水透析改为3M KCNS透析，促使聚合的多聚体解聚。如果抗血清效价较低时，不宜准备胶体金探针。
2、亲和纯化抗体的处理
亲和纯化抗体多是一些商品化的通用抗体，即二抗。一般为羊抗兔、羊抗鼠或羊抗人的抗体。这些抗体一般有两个问题，一是IgG分子往往聚集为多聚体分子，二是往往含有较多的盐分。因此前处理的目的在于脱盐和解聚。
注意：
(1)由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题，胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。
(2)胶体金溶液最好保存在4℃冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存在0℃以下，否则金粒子发生凝聚。
柠檬酸钠（ml）
单宁酸（l）
胶体金（nm）
4
5000
3
4
2000
4
4
500
6
4
120
8
4
70
10
4
10
16
2、白磷还原法制备5 nm胶体金
(1)取250 ml三角瓶一个，加79ml双蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25M K2CO3将溶液调至中性（pH7.0）。
(2)取0.2ml饱和磷/乙醚溶液加到1.5ml试管中，再加0.8ml乙醚，混匀。取0.7ml加入溶液（1）中(磷有毒且易燃，操作请带手套，多余的磷溶液用CuSO4进行中和)。
4、蛋白与胶体金结合最佳pH测定
(例纤维素酶，pI未知)
(1)取若干个1.5ml试管，分别加入1 ml 10 nm胶体金；
(2)用25mMK2CO3将pH分别调为3，4，5，6，7，8，9，10；
(3)取一96孔培养板，按pH从低到高分别将上述胶体金分别取100l加入孔中，重复三次；
(4)每孔分别加入3l浓度为1 mg/ml的纤维素酶，混合，室温下放置10-15 min；
胶体金探针所用蛋白必须要经过前处理，其目的在于（1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。（2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。（3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30kD），形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。
制备好的胶体金保存寿命较长，可4℃保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。
1、单宁酸/柠檬酸钠法制备3～16nm胶体金
(1)取一250 ml三角瓶，加入79ml双蒸水和1ml 1％氯化金，预热至60～70℃。
这里需要特别指出的是，使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定变化。
因此，在探针制备每一环节应随时监测探针对分布情况、负染结合及活性。
1、抗血清的前处理
一般抗血清中IgG的含量为10-25%，而绝大部分为其它蛋白。用抗血清直接制备探针其标记活性与特异性均不理想。因此需去除其中多数杂蛋白。但处理环节不宜太繁，在实验室设备与经验缺乏的情况下更是如此，否则会导致IgG活性的大幅降低。如果你的实验室在蛋白纯化方面有很强的技术支持，高度纯化后效果会更好。
(5)加0.5 ml生理盐水重悬浮，混匀；
(6)逐滴加0.25 ml饱和(NH4)2SO4，充分振荡混匀，4℃静置1 h；
(7)10000 rpm/min离心20 min，弃上清；
(8)重复5～8步骤一次；
(9)加生理盐水0.5 ml重悬浮，混匀；
(10)生理盐水中透析12～24h；
(11)在0.2M pH9.0硼酸缓冲液透析12～24h；
(5)每孔分别加入20l浓度为10％NaCl溶液，混合，室温下放置10 min；
(6)观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH(X)；
(7)重复(1)-(5)步，pH梯度为X-0.6；X-0.3；X；X+0.3；X+0.6；X+1。
(8)观察胶体金颜色变化直到室温下放置2小时，记录仍保持红色的最低pH。
3、IgG Fab片段的制备
一般来说体积较小的探针具有相对较高的标记活性。主要原因在于胶体金颗粒较小时有利于在标记溶液中的扩散运动；在胶体金直径一定时，蛋白分子量越小，金表面吸附的蛋白分子越多，活性位点也越密集，也容易于靶位点结合。
IgG分子量为150kD左右，由4个亚基组成，即两条重链（H）和两条轻链（L）。用水解酶（木瓜蛋白酶）水解后可得到两种片段，即Fab和Fc。其中Fab是具有抗原识别活性的部分，回收后制备探针。Fc能够与Protein A和Protein G特异性结合。但这种分离只能在有条件的实验室进行。
大量工作表明，只用硫酸铵沉淀就可以得到足够纯度及高活性的IgG蛋白。其基本步骤如下：
(1)取抗血清0.2 ml；
(2)加生理盐水（0.85％NaCl）0.3 ml，混匀；
(3)逐滴加入饱和(NH4)2SO40.5ml，充分振荡混匀，4℃静置1 h；
(4)10000 rpm/min离心20 min，弃上清；
其基本步骤如下：
(1)将亲和纯化抗体用生理盐水稀释为0.5-1 mg/ml浓度
(2)在3 M KCNS（硫氰酸钾）溶液中透析12 h
(3)在2mMolpH 9.0的硼酸缓冲液中透析12 h（更换透析液数次）
(4)分装备用
其它蛋白可参考此方法进行。但注意后一种透析液的pH值应与交联时pH值一致。在实际运用中，一般省略去3MKCNS透析这一步，特别是当蛋白分子量较小，且为非糖蛋白时。我们建议在制备通用探针（如二抗IgG，Protein A，Protein G，Streptavidin）等时，严格使用该方法，而制备直接标记探针时，也可以忽略处理步骤。
当蛋白前处理完成后，接着要确定胶体金与蛋白结合的最佳pH值。对于理化性质不确定的蛋白这一步尤为重要。过量的蛋白与不同pH值得胶体金结合后，只有某一特定pH值能够形成结合最稳定的探针。在高浓度电解质（如NaCl）作用下不会凝聚。不同蛋白的适宜pH范围的宽窄大不相同。一般选择最小适宜pH值为最佳pH值。但有些探针的实际情况并不完全如此，最稳定发探针并不完全代表活性最好。这要靠实验验证。
(6)为确保结果准确性，可放大反应体积重复以上步骤。
注：在实际探针制备工作中，蛋白浓度往往为最小浓度的130％。
6、IgG-gold的制备
(1)取两个1.5 ml试管，分别加入1.2 ml 10 nm胶体金；
(2)加入适量25mM K2CO3把pH调整为9.0；
(3)分别加入10l浓度为1 mg/ml IgG，混匀，室温放置10min；
以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂，能够制备大小相对一致、直径3～16nm的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄，而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能够去除这些残基。双标记或制备5-10nm的胶体金时建议使用该方法。