实验二 槐米中芦丁的提取和芦丁水解制备槲皮素

（2）方法二（水提取法）称取槐米粗粉20g，在研钵中研碎后放入500ml烧瓶中，加沸水200ml，用加热磁力搅拌器加热煮沸30min，趁热抽滤。残渣同法操作一次，合并两次滤液，放置冰箱中析晶，待全部析出后，减压抽滤，用少量蒸馏水洗涤芦丁结晶，抽干，得粗制芦丁，干燥，称重，计算得率。
（3）方法三（醇提取法）取槐米20g，置于250ml圆底烧瓶中，加乙醇150ml加热回流1小时，趁热抽滤。滤渣再加乙醇150ml回流1小时，合并乙醇提取液，放冷，析出絮状沉淀，过滤，滤液浓缩至约50ml，放置过夜，滤液析出结晶。母液继续浓缩一半，放置又析出结晶，合并结晶。用乙醚30~50ml分次洗去脂溶性成分（油脂、叶绿素等），再用丙酮10ml洗涤一次，称重，计算得率。
芦丁MW664.6(含三分子水)槲皮素MW338.3（含二分子水）
实验部分
（一）实验目的要求
1.制备芦丁，供药用。
2.通过芦丁的制备，掌握黄酮类化合物的提取分离的原理和操作。
3.掌握黄酮苷水解制备黄酮苷元的方法。
4.熟悉重结晶技巧。
5.了解和掌握黄酮类化合物的一些主要性质和鉴定方法。
（二）实验的基本原理
（3）方法三（乙醇重结晶法）取粗制芦丁2g于100ml锥形瓶中，加乙醇60ml加热溶解，乘热抽滤，将滤液浓缩至约30ml，放置，析出结晶，母液再浓缩一半，又析出结晶，合并结晶，再用乙醇重结晶一次，滤取精制的芦丁结晶，晾干，称重。
3.芦丁的水解
取芦丁1g，置于250ml烧瓶中，加2%H2SO480ml，小火加热微沸回流40min，开始加热10min为澄清溶液，逐渐析出黄色小针状结晶，即槲皮素。放置冷却，静置30分钟，待固体完全析出，抽滤取结晶。加50%乙醇（按1g芦丁用60ml量）加热回流使槲皮素粗晶溶解（方法一）；加50%乙醇（按1g芦丁用90ml量）加热回流使槲皮素粗晶溶解（方法二）；加95%乙醇（按1g芦丁用10ml量）加热溶解（方法三）。趁热抽滤，放置，析晶，抽滤得精制品，在减压下110℃干燥可得槲皮素无水物。
主要化学成分的结构及理化性质：芦丁（Rutin）也称芸香苷，是槲皮素3位上的羟基与芸香糖脱水缩合形成的苷(芸香糖为葡萄糖与鼠李糖组成的双糖)。分子式：C27H30O16·3H2O，淡黄色针状结晶，含三分子结晶水，熔点174～178℃,无水物为188~190℃。易溶于碱液，显橙黄色，酸化后又析出。在冷水中的溶解度为1：10000，热水中为1：200，在冷乙醇中为1：650，在热乙醇中为1：60，在吡啶中为1：12。微溶于乙酸乙酯和丙酮，难溶于苯、三氯甲烷、石油醚等极性小有机溶剂，可溶于硫酸和盐酸，加水稀释又可析出。UV ：259，299，359nm。芦丁用20%H2SO4 水溶液水解可得槲皮素（芦丁的苷元），呈黄色结晶，313～314℃，C15H10O7·2H2O，在热乙醇中溶解度为1：23，冷乙醇中1：290，难溶于水和苯等极性小的有机溶剂，可溶于极性较大的有机溶剂如甲醇、乙酸乙酯、丙酮等。UV ：255，269sh,301sh,370nm。
一、概述
植物来源：槐米系豆科植物槐树（sophora japonicaL.）的花蕾（槐米），芦丁含量高达12%~20%。荞麦中含量也较高。含芦丁成分的植物高达70种以上。
功效：芦丁经药理实验证明具有调节毛细血管渗透作用，具有维生素P样作用。在临床上用作毛细血管止血药，常作为高血压病的辅助用药。芦丁为槐米中主要有效成分。
5 .注意事项
(1)硼砂因能与芦丁中的邻二酚羟基结合，起保护邻二酚羟基，不被氧化破坏的作用。实验证明，提取时加入硼砂，产品的质量会好些。
(2)石灰乳既能达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐米中大量的粘液质和酸性树脂（形成钙盐沉淀），但PH不能过高和长时间煮沸，因为会导致芦丁的水解而开环和形成钙鳌合物，影响产品的质量和产率。
1.芦丁的提取原理
利用芦丁结构中含有多个酚羟基，呈酚酸性，能在碱水中溶解的性质，可用碱性溶剂进行提取，提取液加酸后可沉淀析出（碱溶酸沉法）。也可利用芦丁在冷水中溶解度小，在热水中溶解度大的性质进行提取。
2.芦丁的分离原理
利用芦丁结构在冷乙醇中溶解度小，在热乙醇中溶解度大，以及在热水中溶解度大，在冷水中溶解度小，芦丁用溶剂加热溶解后，趁热抽滤，滤液放冷后就能析出而达到分离的目的（如不纯可再重复操作进行分离）。也可采用醇-水法进行精制。
4.鉴定
（1）点滴显色反应取芦丁和槲皮素的甲醇溶液（供试液）分别点在滤纸上，挥去溶剂，然后分别加下列试剂，观察显色前后颜色及荧光的变化。
供试液：芦丁、槲皮素的甲醇溶液。
显色剂：2%三氯化铝乙醇溶液[在紫外灯下λ365nm观察显色前后颜色及荧光的变化]
（2）薄层色谱鉴定
吸附剂：硅胶GF254薄层板（5.0cmX10.0cm）。
3.芦丁的鉴定原理
（1）利用吸附薄层色谱的分离原理，芦丁与芦丁对照品在同一条件下进行展开，显色，以达到鉴定芦丁的目的。
（2）通过专属的化学显色反应，确定芦丁的成分类型（黄酮类）。
(三)实验内容
1.用酸碱法、水提法、醇提法提取槐米中芦丁。
2.在酸性条件下加热回流水解芦丁，制备槲皮素。
3.பைடு நூலகம்剂重结晶纯化芦丁和槲皮素。
2.芦丁的精制
（1）方法一（醇-水重结晶法）取粗制芦丁2g，置于250ml园底烧瓶中，加乙醇60ml加热回流15分钟，趁热抽滤。滤液置250ml烧杯中，向滤液中加蒸馏水（约3~4倍量）至溶液呈明显混浊，室温放置，抽滤得精致芦丁。用少量蒸馏水洗涤芦丁结晶，晾干，称重。
（2）方法二（水重结晶法）取粗制芦丁2g，加入蒸馏水400ml，加热回流至芦丁全部溶解，趁热立即抽滤，冷却后即可析出结晶，抽滤，得芦丁精制品，晾干，称重。
(3)PH过低（酸性太强）会使芦丁形成洋盐而收率降低。
⑷ 称量芦丁或槲皮素时，先将带滤纸的漏斗称重，再将盛样品的带滤纸的漏斗称重，差重即为样的重量。
（五）实验方法与注意事项
1.芦丁的提取
（1）方法一（碱溶酸沉法）称取槐米粗粉20g，在研钵中研碎后放入500ml烧瓶中，加0.4%硼砂水溶液200ml，用加热磁力搅拌器加热微沸后，加石灰乳（1.5g氧化钙加入10ml水研成乳液）调PH8~9，一边加一边搅拌，加热微沸30min，补充失去的水分，并保持溶液PH8~9，静置约5分钟过滤（或趁热抽滤），药渣（第二次提取）再用0.4%硼砂水溶液200ml煮沸半小时（此时不需加石灰乳），随时加水补充失去的水分，合并两次滤液（总体积约400ml），放冷（60~70℃），小心滴加浓盐酸，同时快速搅拌调制溶液PH4，室温放置或在冰箱中放置（过夜），沉淀，待全部沉淀物析出后，减压抽滤，用少量蒸馏水（约10ml）洗涤芦丁粗品，抽干，室温下晾干，得粗制芦丁，称重，计算得率。
样 品：自制芦丁、槲皮素（用甲醇溶解，浓度约1mg/ml）
对照品：芦丁、槲皮素对照品的甲醇溶液。
展开剂：三氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶2.5∶0.5）
显 色：a.先在可见光下观察，然后在紫外光下观察（365nm紫外灯下观察）
b.喷三氯化铝试剂前后观察颜色变化（365nm紫外灯下观察）
实验结果记录：观察斑点颜色，记录图谱并计算Rf值。
20g在研钵中研碎后放入500ml烧瓶中加04硼砂加石灰乳15g氧化钙加入10ml水研成乳液调ph89分钟过滤或趁热随时加水补400ml放冷6070c小心滴加浓盐酸同时快速搅拌调过夜沉淀待全部沉淀物析出后减压抽滤用少量蒸馏抽干室温下晾干得粗制芦丁称重计算得率
实验二槐米中芦丁的提取和芦丁水解制备槲皮素
其他成分理化性质：皂苷（saponin）粗品为白色粉末，m.p.210～220℃。易溶于吡啶。能溶于200倍的甲醇，酸水解后获得两种苷元（白桦酯醇、槐花二醇）及糖（糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄糖醛酸内酯）。白桦酯醇（betulin）无色针晶，m.p215～217℃,能溶于醋酸、丙酮、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、三氯甲烷、苯等；难溶于石油醚。槐花二醇（Sophoradiol）无色针晶，m.p219～220℃或224℃，溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇，难溶于水。芦丁和槲皮素结构式如下所示。
4.薄层色谱法和显色反应鉴定芦丁和槲皮素
(四)实验药材仪器与试剂
1.实验药材槐米20g。
2.仪器：500ml烧杯，1000ml烧杯，250ml园底烧瓶、100ml量筒、50ml量筒、100ml锥形瓶、50ml锥形瓶、研钵、减压过滤装置，布氏漏斗，层析缸等。
3.试剂：硼砂、氧化钙、HCI、H2SO4、三氯化铝、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、甲酸、滤纸等。