脱氢酶活性的测定

脱氢酶活性的测定（参照胡晋的论文“对种子活力测定方法-TTC定量法的改进）
1、实验原理
TTC（三苯基四氮唑）接受活种子代谢过程中呼吸链上的氢，变成还原态的红色的TTCH（三苯基甲-）。TTCH不溶于水，溶于乙醇。可用乙醇提取，红色愈深，表明种子活力愈高。提取液用分光光度计比色，光密度值越高，活力越强。
2、实验步骤
（1）取液氮保存的种子和对照（保存在冰箱Hale Waihona Puke Baidu度）种子，设置三个重复，每个重复25粒种子，在无菌水浸种24-28h，使种胚吸胀，小心无伤取胚，再进行TTC染色法。
（2）将种胚置于试管内，加入0.1%TTC溶液（磷酸缓冲液配制）5毫升，试管加塞，在35度黑暗条件下染色2小时。到时间后，倒出TTC液，用水冲洗2~3次，用滤纸吸取种子表面水分。
（3）将吸干水分的种子倒入干燥的试管，加入8毫升无水乙醇，将试管置于80度水浴中提取红色物质，待胚部变白色后（约6-8小时）停止提取，冷却后将提取液出比色。
（4）以无水乙醇为参照（较零），在485nm波长测定光密度值（OD）.
3数据录用方式（录入EXCOL），形式如下
品种
OD1
OD2
OD3
平均值
小红豆（液氮保存）
对照（低温冰箱保存）
等等
实验器材和试剂：
试剂：
1.乙醇2000毫升（4瓶）
2.磷酸缓冲液pH 7配制见生化实验指导书。
磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制
3TTC
仪器：
分光光度计
水浴锅
磁盘
滤纸
带塞试管50
小镊子2把