焦磷酸测序步骤
一、实验操作
（一）甲基化检测
亚硫酸氢盐转化
1． bisulfite Mix+800μL Rnase free water，窝旋5min/60℃加热窝旋混匀（配置好的bisulfite Mix勿放置冰上）
2. 配置buffer反应液，室温混匀：DNA Solution （1μg）+RNAfree water 共20μl+
bisulfite Mix 85μl+DNA protect buffer 5μl，（配置好的体系为140μl，不方便上PCR仪，最好分为两管70μl）
3. 上PCR仪，95℃5min→60℃25min→95℃5min→60℃85min→95℃5min→60℃175min
→20℃20min，热循环结束，将PCR product转入Spin-column，加入560 Buffer BL。
（当DNA微量时，需要加入carrier RNA，其加强DNA与column膜的结合；当DNA 量>100ng，则不需要加入carrier RNA）混匀，12，000rpm，1min，废弃液。
4. 清洗Bisulfite DNA convertion
1）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
2）加入500μl buffer BD，室温放置15min（加入buffer BD快速盖盖子，避免出现白色沉淀）
3）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
4）加入500μl buffer BW，12,000rpm，1min，废弃液。
5） 12,000rpm，1min，废弃液。
6） 56℃5min（蒸发残余液体）
7） 20μl Buffer EB溶解，12,000rpm，1min（-20℃，可保存3年）
PCR扩增目的片段
回收的PCR product 1：5稀释→取2μl→PCR→准备焦磷酸测序
焦磷酸测序
1．在PCR板中，准备微珠预混液配制（每管）
1）Beads：3μl，Binding Buffer，40μl，模版：20μl，dd Water：补足80μl。
2）震荡20min（如果准备工作没做好，可延长震荡时间）
2.焦磷酸测序样品准备
1）清洗探头2-3次，最后一次将探头竖直举起，抽出残余水分，将70%乙醇、变性液、洗液倒入相应的位置
位置不同）
2
3）在酶标版中，准备预混液（每管）：Aneal Buffer：40μl，Sprinmer（100pmol）：0.2μl 4）探头吸附微珠预混液：探头放置70%乙醇，看到液体从关中出来，探头竖直举起；探头放置变性液，看到液体从管中出来，探头竖直举起；探头放置洗液，看到液体从管中出来，探头竖直举起直至水抽干；将探头对准酶标版，关闭真空，停留3s后，探头置入酶标版，轻轻晃动探头；将酶标版80℃2min，室温直至手感不热，放入仪器；5）打开CpG software，可提前设置软件，RUN。
