毛霉蛋白酶的催化特性及动力学研究

关键词： 雅致放射毛霉；蛋白酶；催化特性；动力学
中图分类号： TS 201.2
文献标志码： A
文章编号： 1005-9989(2010)11-0036-05
Catalytic and kinetic properties of one protease from Mucor
PAN Jin-quan
(Life Science and Technology School, Zhanjiang Normal University, Zhanjiang 524048)
定蛋白酶的活化能 Ea。
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生物工程
食品科技
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010 年 第 35 卷 第 11 期
1.2.9 热失活动力学 将适当稀释后的酶液放置于 50 ℃的水浴中保温，每间隔一定时间取样测定蛋 白酶的活性，观察保温过程中蛋白酶活性的变化。 定义初始的蛋白酶相对活力为 1，对所得实验数据 进行非线性的模型拟合。 1.2.10 数学模型参数拟合的程序 用 Origin 7.0 程 序以非线性回归法拟合各种实验数据模型的参数。
照蛋白酶活力测定方法，分别于不同的温度(40～
75 ℃范围)下测定毛霉蛋白酶的活性，考察温度对
毛霉蛋白酶活性的影响。
在蛋白酶的稳定 pH 条件下，将酶液分别于不
同温度(30～70 ℃范围)下保温 30 min，测定保温前
后蛋白酶活性的变化，考察温度对蛋白酶稳定性
的影响。
1.2.6 抑制剂及金属离子对毛霉蛋白酶活性的影响
催化活性，在 pH6～9 和低于 45 ℃具有很好的稳定性；在 40 ℃该蛋白酶水解酪蛋白的反应符合
米氏方程：V=
22.8S S+8.857
；在 4～45 ℃的范围内，该蛋白酶水解酪蛋白反应的活化能 Ea 为 44.09
kJ；该蛋白酶在 50 ℃不稳定，其热失活规律符合一级指数衰减动力学模型：a=exp(－0.218t)。
用不同的缓冲液分别调节酶液的 pH 到 4.0、 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于室温(25 ℃)放置
1 h，然后分别在 pH9.5 的条件下测定蛋白酶的活
性，计算酶活残留率。以酶活残留率对 pH 作图，
绘制蛋白酶的 pH 稳定性曲线。
1.2.5 温度对毛霉蛋白酶活性及稳定性的影响 按
度在 50 ℃。 2.3 抑制剂及金属离子对蛋 白酶活性及 稳定性的 影响
表 1 抑制剂及金属离子对蛋白酶活性的影响
抑制剂 无
PMSF Leupeptin Aprotinin
EDTA E-64 Pepstatin DTT Triton X－100 SDS SDS Ca2＋ Mg2＋ Zn2＋ Fe2＋ Mn2＋ Cu2＋ Co2＋
120
100
相对酶活/%
80
60
40
20
温度-活性曲线
温度-稳定性曲线
0
25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80
温度/℃
图 2 温度对蛋白酶活性及稳定性的影响
考察了温度对毛霉蛋白酶活性及稳定性的影 响，结果如图 2 所示。毛霉碱性蛋白酶是 1 种中
高温蛋白酶，在 60 ℃有最高的催化活性；该蛋白 酶组分在低于 45 ℃的条件下具有很好的热稳定 性，保温 30 min 后其酶活基本没有损失；当环境 温度在 50 ℃时，该蛋白酶会缓慢的失活，而一旦 温度超过 60 ℃则极不稳定，放置 30 min 活性损失 达到 60%，2 h 后活性几乎完全丧失。综合以上的 实验结果，可以初步确定该碱性蛋白酶的使用温
在蛋白酶的稳定 pH 条件下，将酶液与不同类
型的抑制剂、化学物质及无机盐混和，然后在室
温中放置 30 min，测定加入抑制剂前后蛋白酶的
活性。考察蛋白酶抑制剂及化学物质对毛霉蛋白
酶活性的影响。
1.2.7 米氏常数测定 按照蛋白酶活力测定方法，
于 40 ℃ pH9.5 的条件下，以不同浓度(0、0.5、1、
℃, and the kinetics of deactivation fit the model: a=exp(－0.218t).
Key words: Actinomucor elegans; protease; catalytic properties; kinetics
毛霉是腐乳发酵生产的主要菌种，在腐乳生 产工艺中其主要作用是分泌蛋白酶水解豆腐胚内 的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白质主要是以多肽 的形式存在的，具有相当高的水解程度，并且已 经 从中分离出 多 种 具 有 生 理 活 性 的 多 肽 [1- 2]。 而 对 众多腐乳产品的感官分析也表明，腐乳产品通常 不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。综合以上
2 结果与分析
2.1 pH 对蛋白酶活性及稳定性的影响
1ຫໍສະໝຸດ Baidu0
100
相对酶活/%
80
60
40 pH-活性曲线
20
pH-稳定性曲线
0
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH
图 1 pH 对蛋白酶活性及稳定性的影响
如图 1 所示，纯化得到的毛霉蛋白酶组分是 一典型的碱性蛋白酶，该蛋白酶在 pH＞8.0 的范 围内有相对较强的催化活性，其最适作用 pH 在 8.5～9.5 范围；另外，该蛋白酶在 pH6.0 也具有一 定的催化活性，表明该蛋白酶组分在腐乳的发酵 生产中也起到了一定的作用。该蛋白酶在 pH6.0～ 9.0 的范围内能保持很好的稳定性，室温放置 1 h 后其酶活残留率高达 85%以上；在 pH 低于 5.0 的 酸性环境中该蛋白酶很不稳定，而且随 pH 降低其 失活速度迅速加快。 2.2 温度对蛋白酶活性及稳定性的影响
浓度 a -
1 mmol/L 1 mmol/L 15 μmol/L 10 mmol/L 100 μmol/L 1 μmol/L 100 mmol/L
5% 0.1% 0.5% 5 mmol/L 5 mmol/L 5 mmol/L 5 mmol/L 5 mmol/L 5 mmol/L 5 mmol/L
相对酶活/% 100
2、4、6、8、10、12、16、20 g/L)酪蛋白溶液为底
物测定蛋白酶活性，考察底物浓度与蛋白酶活性
的关系。以米氏方程为模型，对实验数据进行非
线性拟合，由此确定米氏方程中的参数 Vm 和 Km。 1.2.8 活化能的测定 根据化学反应动力学理论，
在酶的稳定性不受影响的前提下(即酶的失活速度
很低，可以忽略)，温度对酶促反应速度的影响符
收稿日期： 2010-03-13 基金项目： 广东省自然科学基金项目(9452404801001943)。 作者简介： 潘进权(1978—)，男，博士，讲师，主要从事酶与发酵工程相关领域的研究工作。
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Abstract: One protease was purified from extracellular of Actinomucor elegans AS3.2778 and its catalytic and
kinetic properties were also investigated. The results show that the purified protease was one alkaline serine
protease, which has relatively higher activity at pH8.5～9.5 and 60 ℃, and is stable at pH6.0~9.0 at ＜45 ℃. At
40
℃,
the
kinetics
of
casein
hydrolysis
by
the
protease
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其具有合成及分泌多种胞外蛋白酶的能力，因此， 单纯从总体上(即粗酶的研究)并不能完全了解其内 在的特性。为了更加全面地了解这一蛋白酶系的 组分构成、各组分催化特性及相互作用，笔者开 展了这方面的工作。
在前期的工作中，利用多种层析相结合的方 法从毛霉胞外纯化出一蛋白酶组分，并探讨了该 蛋白酶组分对大豆蛋白的水解特性[6]。为了更全面 地了解该组分的特性，本研究将以酪蛋白为底物 对其催化特性及动力学进行分析，其结果将为该 蛋白酶组分的应用奠定理论基础。
fit
the
Mchaelis-Mentonequation:
V=
22.8S S+8.857
,
and
the
energy of activation (Ea) of this hydrolysis reaction below 45 ℃ is 44.09 kJ. The protease was unstable at 50
结果来看，毛霉蛋白酶在解决大豆蛋白水解率低、 水解物的苦味等难题方面具有很大的潜力。
毛霉虽然在发酵工业中的应用有着悠久的历 史，但是对这类菌种胞外蛋白酶系的研究却并未 完全开展。仅有极少数学者对该菌种的发酵产酶 特 性 及 粗 酶 的 催 化 、 水 解 特 性 进 行 过 探 讨 [3-5]。 然而，毛霉由于长期受到高蛋白环境条件的驯化，
酶活力单位定义(即蛋白酶水解酪蛋白反应速 度单位的定义)：在酶活测定条件下反应 10 min， 每分钟每毫升蛋白酶液水解酪蛋白产生 1μg 酪氨 酸定义为一个蛋白酶活力单位。 1.2.4 pH 对毛霉蛋白酶活性及稳定性的影响 按 照蛋白酶活力测定方法，分别于不同 pH 缓冲条件 下(pH3.0~5.0，0.05 mol/L 乙酸缓冲盐；pH6.0 ~7.0， 0.05 mol/L 磷 酸 缓 冲 盐 ； pH7.5~9.0， 0.02 mol/L Tris- HCl；pH 9.5~10.5，0.02 mol/L 甘氨酸 - NaOH) 测定毛霉蛋白酶的活性，考察 pH 对毛霉蛋白酶活 性的影响。
方程：k=Aexp(-
Ea RT
)
式中：A 为指前因子；
Ea 为反应活化能；
R 为气体常数，8.31 J/mol·K；
T 为绝对温度。
在酶的稳定温度范围内，酶促反应速率 lnr 与
温度 1/T 成线性关系，其斜率为 - Ea/R。根据这一
理论，分别在不同温度下测定蛋白酶的活性。然
后对实验数据进行上述的线性拟合，从而可以确
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毛霉蛋白酶的催化特性及 动力学研究
潘进权 (湛江师范学院生命科学与技术学院，湛江 524048)
摘要： 从雅致放射毛霉胞外分离纯化出一蛋白酶组分，以酪蛋白为底物对其催化特性及动力学
进行了分析。结果表明：该蛋白酶组分是一种碱性丝氨酸蛋白酶；在 pH8.5～9.5、60 ℃具有最大
1 材料与方法
1.1 材料及试剂 雅致放射毛霉 As3.2778：生物学院微生物实
验室保藏菌种；其他试剂：国产分析纯。 1.2 实验方法 1.2.1 蛋白酶的提取 取毛霉固体发酵后的麸曲碾 碎，以 1∶10(m/v)的比例加入 0.3 mol/L NaCl 溶液， 在 40 ℃ 水 浴 抽 提 1.5 h， 纱 布 过 滤 后 在 4 ℃ 以 8000 g 离心 10 min，取上清液即得到粗酶液。 1.2.2 蛋白酶的纯化 具体方法见文献[6]。 1.2.3 蛋 白 酶 活 力 的 测 定 采 用 Folin 酚 法 [7]。 1.5 mL EP 离心管中加入 0.3 mL 适当稀释的酶液及 0.3 mL 1.5%酪蛋白(溶于 0.02 mol/L pH9.5 的甘氨酸 - 氢氧化钠缓冲液)，40 ℃反应 10 min，再加 0.6 mL 0.4 mol/L 的三氯乙酸终止反应，静置 15 min 后 14000 g 离心 10 min，取上清液 0.6 mL，加入 3 mL 0.4 mol/L 的碳酸钠溶液及 0.6 mL 福林酚试剂，40 ℃显色 20 min，于 680 nm 测其吸光值，根据标准 曲线计算酶活单位。
合阿累尼乌斯(Arrhenius)方程。另外，在通常情况
下，酶活力测定时其底物浓度 Cs 是远远过量的，
Cs 的微小变化对酶促反应速率的影响可以忽略，
即反应速度不受底物浓度 Cs 的影响，此时的酶促 k
反应遵循零级化学反应规律，即对于反应：S→P
有速率方程：r= dCs =k dt
根据
Arrhenius