实验一 细菌的简单染色和细菌形态的观察
一、实验原理
简单染色采用一种染料对菌体进行染色，常用结晶紫、美蓝、碳酸复红等碱性染料。染色后，
菌体与背景形成鲜明对比，在显微镜下很容易被识别。通过简单染色方法可以观察细菌的菌
体形态特征和菌体的排列方式。
观察菌体形态
简单染色
（只用一种染料） 观察菌体排列方式
染色方法 革兰氏染色
鉴别
鉴别染色 抗酸性染色
（利用两种染料） 芽孢染色
观察特殊结构 荚膜染色
鞭毛染色
二、实验步骤：
涂片 干燥 固定 染色 水洗 干燥 镜检
三、思考题
1、制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节？
答；（1）涂片：开始所加无菌水液滴不要太大，否则不易干燥；
取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免过大造成堆积，而难以看清细胞个体形态
同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。
（2）无菌操作取菌：一定要等接种换冷却后再取菌，以免高温使菌体变形；
（3）干燥固定：干燥后加热固定，可避免加热时间过长，否则细胞会破裂或变形；
（4）固定：菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。注意温度不宜过高，时间不宜太长，否
则菌体形态则会发生改变。
（5）水洗：倾去染色液后，用水沿着菌膜四周冲洗，注意勿使水流直接冲洗菌膜部位，水
流不宜过急，过大，至流出水无色为止；
2、为什么要求制片完全干燥才能用油镜观察？
答：使用油镜时，物镜与标本间的介质为香柏油（N=1.515），不仅增加了透明度，而且会提
高了分辨率。
若制片不完全干燥后，就用油镜观察，则N 会减小，分辨率D 也会变小。而且还会造成油
水两相不互溶，所以制片要求完全干燥后才能用油镜观察。
3、如果涂片未经加热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高，时间太长，又会怎样
呢？
答：加热固定的作用是使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大
多数细菌而且不破坏细胞形态，而且还可增加细胞对染料亲和力。
（1）如果图涂片未经加热固定，则细胞无法固定在载玻片上，在染色水洗后会被水流冲走。
（2）如果加热温度过高，时间太长，则会使细菌形态发生变化甚至破裂。
4、为什么细菌染色常用碱性染料？什么情况下用酸性染料？
答：（1）细菌染色常用碱性染料，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中通常带
负电荷，而碱性染料电离后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。
（2）当细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
实验二细菌的革兰氏染色法
一、实验原理
革兰氏染色是细菌染色中重要的鉴别染色方法之一。通过革兰氏染色法可将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌(G-)。
G+和G-主要是由于细胞壁结构和化学成分的差异引起脱色能力的不同。
①结晶紫初染和碘液媒染:在细菌的细胞膜内可形成不溶于水的结晶紫与碘的化合物。
②乙醇脱色：细胞壁较厚结晶紫与碘液复合物留在细
G+ 胞壁内，使其保持紫色。
肽聚网层次多和交联致密且不含类脂
细胞壁较薄结晶紫与碘复合物溶出，细
G- 胞壁退成无色
肽聚网层薄和交联差，外膜层类脂含量高
③番红染色：G-细菌呈现红色，而G+细菌则仍保留最初的紫色。
二、实验步骤立即水洗干燥
结晶紫碘液G+：蓝色
菌体紫
初染媒染G-G-：红色
1、涂片：“三区”涂片法，在一洁净的载玻片偏左和偏右各加一小滴。用灭菌的接种环挑取少许枯草芽孢杆菌与右边的水滴充分混合，将左、右方的菌液延伸与玻片中央，使大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在玻片中间区域相互混合成含有两种菌的混合区。
2、干燥：涂片在空气中干燥
3、固定：手持载玻片一端，有菌膜一面朝上，通过酒精灯微火三次。注意用手指触摸载玻片反面为不烫为宜。冷却。
4、染色：滴加结晶紫染色液于菌膜部位，覆盖菌膜，染色1~1.5min。
5、水洗：斜置玻片倾去染色液，用水自玻片上端缓慢冲洗。注意勿使水流直接冲洗菌膜部位。
6、媒染：滴加碘液于菌膜部位，覆盖菌膜，放置1~2min。
7、水洗：同上
8、脱色：斜置玻片，自标本的上端缓慢滴加95%乙醇脱色，直到留下的酒精无明显的紫色为止。脱色是革兰氏染色中的关键一步，注意不要脱色过度。
9、水洗：同上
10、复染：滴加番红染色液，染色1min.
11、水洗并用吸水纸自载玻片边缘轻轻吸去多余水分。
12、镜检。
三、思考题
1、什么是鉴别染色？有何优点？
答：（1）鉴别染色是指至少使用两种不同颜色的染色剂进行染色。
（2）优点：可以区分不同类别的菌种；可以很好地观察菌体结构；
2、革兰氏染色法中初染、媒染、脱色、复染的目的是什么？
答：初染：利用结晶紫初染使所有细菌都着上蓝紫色。
媒染：利用碘液作为媒染剂，碘会与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强染料在菌体中的滞留能力
脱色：用95%乙醇作为脱色剂，根据G+和G-细胞壁机构和化学组成的差异，G+的肽聚网孔会收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，而G-中原先滞留的碘-结晶紫
复合物容易被洗脱下来，菌体变无色。
复染：用番红作为复染剂把洗脱的G-染成红色，而G+仍为蓝紫色。
3、革兰氏染色反应的关键步骤是什么？为什么？
答：革兰氏染色反应的关键步骤是脱色；
①若脱色不够的话，则大肠杆菌中的碘-结晶紫复合物不能被洗脱下来，或无法完全被洗脱下来，那么之后用番红复染时不会变成红色，而是呈紫色，造成大肠杆菌的假阳性。
②若脱色过度的话，则金黄色葡萄球菌中的碘-结晶紫复合物也会被洗脱下来，那么之后用番红复染细胞呈红色，造成金黄色葡萄球菌的假阴性。
实验五酵母菌形态的观察
一、实验原理（略）
二、实验步骤
1、酵母个体形态与出芽繁殖
接种与培养制片观察
2、假菌丝形态
接种与培养制片
3、酵母细胞的死活染色鉴别
涂片、染色观察
三、思考题
1、显微镜下观察的酵母菌的个体形态特征与细菌个体形态特征有何不同?
答：（1）细菌是一类细胞细短的原核生物，一般直径约为：0.5μm，长度约为：0.5~5μm。显微镜下观察的细菌个体形态基本上是球状、杆状、螺旋状三大类，仅少数为其他形状，如丝状、三角形、方形和圆盘形等；
（2）酵母菌的细胞直径约为细菌的10倍，是典型的真核生物，在显微镜下观察的酵母菌个体形态通常是有球状、卵圆状、椭圆状、柱状和香肠状等。
2、美蓝色染色液染色时间对酵母菌死活细胞数量有何影响？试对所得的结果进行分析和讨论。
答：美蓝染色液染色时间越长，酵母菌死细胞数量越多，而活细胞数量越少。
实验六霉菌形态的观察
1、试分析Subouraud 琼脂培养基的优点？
答：①pH偏酸性，适合霉菌生长；
②氯霉素可抑制细菌的生长；
2、载片培养法中“U”形玻璃棒和培养皿底部的滤纸上加入适量灭菌水的目的是什么？除了加灭菌水之外，还可以加入什么溶液？
答：①目的是保证培养皿内适宜温湿度；
