整个基因克隆实验流程(完整)

以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。

它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。

加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。

RNA存在于水样层中。

收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。

在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。

乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。

共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。

TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。

所有的操作可以在一小时内完成。

TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。

故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。

并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。

Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。

例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。

当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。

一、实验目的1. 学习基因克隆的基本原理和方法。

2. 掌握PCR扩增、酶切、连接等基因克隆实验技术。

3. 验证目的基因的克隆是否成功。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段从基因组中分离出来，并插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。

实验过程中，主要涉及PCR扩增、酶切、连接、转化、筛选等步骤。

三、实验材料1. 模板DNA：含有目的基因的基因组DNA。

2. 引物：根据目的基因序列设计的上下游引物。

3. Taq DNA聚合酶：用于PCR扩增。

4. 酶切体系：限制性内切酶、缓冲液、连接酶等。

5. 连接载体：线性化载体。

6. 转化宿主菌：大肠杆菌DH5α。

7. 筛选培养基：含抗生素的LB培养基。

8. PCR扩增试剂：10×PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2等。

四、实验方法1. PCR扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计上下游引物，长度约为20-30bp，分别位于目的基因的上下游。

（2）PCR反应体系：取模板DNA 1μl，上下游引物各1μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl2 2μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至50μl。

（3）PCR反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸10min。

2. 酶切连接（1）酶切：取PCR产物5μl，加限制性内切酶（如EcoRI）1μl，10×酶切缓冲液2μl，ddH2O 2μl，混匀后置于37℃水浴酶切2h。

（2）连接：取线性化载体5μl，酶切产物5μl，10×连接缓冲液2μl，T4 DNA 连接酶1μl，混匀后置于16℃连接过夜。

3. 转化（1）制备感受态细胞：将大肠杆菌DH5α在LB培养基中培养至对数生长期，按照1:100的比例加入CaCl2，混匀后冰浴30min。

（2）热激转化：将连接产物加入感受态细胞中，混匀后置于42℃水浴45s，迅速转移至冰浴中。

整个基因克隆实验规程完整Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】一、组织总RNA的提取相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。

相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。

实验步骤1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。

2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解；3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min；4.4℃，,12000g 离心15min；此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中；5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀；6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min；7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min；8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀；9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解）10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。

RNA质量检测相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB）相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机）相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒）（1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。

基因克隆方案基因克隆是现代生物学中一项重要的技术手段，可以帮助科学家们研究和理解基因在生物体内的功能以及相互作用关系。

本文将介绍一种基因克隆的方案，包括所需材料、实验步骤以及预期结果。

材料准备：1. 原核或真核生物DNA样本2. 大肠杆菌或其他合适的宿主细胞3. 抗生素培养基4. 离心管和显微管5. 高速离心机6. 热循环仪7. DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶等相关试剂实验步骤：1. DNA片段的制备a. 提取所需的DNA样本，并利用限制性内切酶进行酶切，得到所需的目标DNA片段。

b. 进行DNA片段的纯化，通过凝胶电泳确认目标DNA片段的大小，并将其收集起来。

2. 载体的制备a. 准备合适的载体，如质粒或病毒。

b. 利用限制性内切酶对载体进行酶切，以开放载体的多个切位。

c. 将目标DNA片段与载体进行连接，使用连接酶催化反应使其稳定结合。

3. DNA的转化与筛选a. 将连接好的DNA测序样本转化到合适的宿主细胞中，如大肠杆菌。

b. 将转化后的细胞培养于含有抗生素的培养基上，以筛选带有目标DNA的克隆。

c. 通过PCR等方法检测筛选出的克隆是否携带目标基因，确认克隆是否成功。

4. 克隆的扩增与提取a. 选择带有目标基因的克隆进行扩增培养。

b. 利用高速离心机将细胞进行离心分离，提取出目标DNA。

预期结果：经过以上步骤，我们可以获得目标基因的克隆并进行扩增。

在实验结果中，我们能够观察到目标DNA片段在凝胶电泳图谱中的特定带状条带，同时，通过PCR验证可以进一步确认克隆是否成功。

此外，最终扩增的目标基因克隆可以用于后续的实验研究，如转基因生物的构建或基因功能的研究。

总结：通过以上实验方案，我们可以使用基因克隆技术获得目标基因的克隆，并获得扩增后的纯净DNA样本。

这项技术在现代生物学和医学研究中具有广泛的应用前景，为科学家们研究基因的功能及其在人类健康中的意义提供了关键的工具。

然而，需要注意的是，基因克隆技术的操作需要严格遵守实验室安全规范，并经过充分的训练，以确保实验的准确性和安全性。

目的基因T载体克隆实验步骤pcr产物的t载体克隆一.重组质粒的构建：重组的dna分子就是在dna连接酶的促进作用下，存有mg切的载体分子与外源dna分子进行连接。

dna连接酶存有两种：t4噬菌体dna连接酶和大肠杆菌dna连接酶。

两种dna连接酶都存有将两个具有相同粘性末端的dna分子连在一起的功能，而且t4噬菌体dna连接酶除了一种大肠杆菌dna连接酶没的特性，即为能够并使两个平末端的双链dna分子连接起来。

但这种相连接的效率比粘性末端的相连接率为高，通常可以通过提升t4噬菌体dna 连接酶浓度或减少dna浓度去提升平末端的相连接效率。

t4噬菌体dna连接酶催化剂dna 连接反应分成3步：首先，t4dna连接酶与辅因子atp构成酶-atp复合物；然后，酶-atp 复合物再融合至具备5’磷酸基和3’羟基切口的dna上，并使dna腺苷化；最后产生一个代莱磷酸二酯键，把切口封出来。

连接反应通常将两个相同大小的片断相连。

很多dna聚合酶在进行pcr扩增时会在pcr产物双链dna每条链的3’端加上一个突出的碱基a。

pucm-t载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的t。

这样，pucm-t载体的两端就可以和pcr产物的两端进行正确的at配对，在连接酶的催化下，就可以把pcr产物连接到pucm-t载体中，形成含有目的片断的重组载体。

连接反应的温度在37℃时有助于连接酶的活性。

但是在这个温度下黏末端的氢键融合就是不稳定的。

因此实行折衷的温度，即12-16℃，相连接12-16h（过夜），这样既可以最大限度地充分发挥连接酶的活性，又兼具至较长时间接合结构的平衡。

2、atp存有的相连接缓冲器系统中，将分别经酶二.感受态制备原理细菌在0ccacl2低渗溶液中胀变成球形，遗失部分膜蛋白，沦为难稀释外源dna的状态。

三.β-半乳糖甘酶显色反应选择法（蓝白筛选）原理lacz基因是大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因，可以编码β—半乳糖核苷酶。

基因克隆步骤完整版基因克隆是一项复杂的生物技术，可以用于生物研究、药物开发和农业改良等领域。

下面是基因克隆的完整步骤：1.设计克隆实验方案：首先，确定要克隆的基因序列。

这可以是来自同一物种的已知基因，或者是从其他物种中提取的基因。

然后，设计适当的引物（引物是专门设计用来扩增特定DNA序列的短片段）用于PCR扩增。

2.DNA提取：提取目标组织或细胞中的DNA。

常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、盐法和商业DNA提取试剂盒等。

3.PCR扩增：使用引物和DNA模板进行多轮PCR扩增，从而产生大量目标基因的复制。

4.凝胶电泳：将PCR产物进行凝胶电泳分析，以确认扩增是否成功，并确定目标基因的大小。

5.DNA纯化：将目标基因的PCR产物从凝胶中切割并纯化。

这通常通过使用商业DNA凝胶提取试剂盒来完成。

6.多重限制性内切酶切割和连接：根据克隆方案中的设计，使用适当的限制性内切酶切割DNA。

然后，将目标基因连接到一个载体DNA中，这个载体DNA称为克隆载体。

克隆载体通常是一个圆形的质粒DNA。

7.转化：将克隆载体插入到宿主细胞中。

这可以通过热激冷转化、电转化或化学转化等方法实现。

8.筛选转化子：使用适当的筛选方法筛选转化子。

这可以通过选择性培养基，例如含有抗生素的培养基，或者通过对转化子进行荧光筛选等方法。

9.扩增：从筛选出的阳性克隆中提取DNA，并使用PCR或其他方法进行扩增。

10.序列分析：对扩增的DNA进行序列分析，以确认克隆是否成功。

这可以通过将DNA提交给商业实验室进行测序，或者使用自动测序设备进行测序。

11.功能分析：对克隆所得基因进行功能分析。

可以通过转基因生物的研究，观察基因对生物表型的影响。

12.存储和应用：将克隆所得的基因保存在冷冻库中，以备后续研究或应用。

总结：基因克隆是一项复杂的过程，包括基因序列设计、DNA提取、PCR扩增、凝胶电泳、DNA纯化、限制性内切酶切割和连接、转化和筛选转化子、扩增、序列分析、功能分析和存储等步骤。

全基因组测序逐步克隆法的原理与流程分析全基因组测序逐步克隆法是一种常用的基因克隆方法，可以用于测定整个生物体的基因组序列。

该方法通过将DNA分子切割成多个较小的片段，逐步将这些片段克隆并测序，最终得到完整的基因组序列。

本文将对全基因组测序逐步克隆法的原理与流程进行详细分析。

一、原理全基因组测序逐步克隆法的原理基于Sanger测序技术和限制性内切酶切割的原理。

该方法先将DNA样本进行限制性内切酶切割，得到许多不同长度的DNA片段。

然后，这些DNA片段逐个进行克隆，并经过Sanger测序技术进行序列测定。

最后，根据测序结果，通过重叠匹配等方式将这些片段拼接起来，得到完整的基因组序列。

二、流程全基因组测序逐步克隆法的流程包括DNA提取、限制性内切酶切割、DNA片段克隆、Sanger测序和序列拼接几个关键步骤。

1. DNA提取：将感兴趣的生物体样本（如细胞、组织等）中的DNA提取出来。

这可以通过破碎细胞壁、裂解核膜等方式进行。

2. 限制性内切酶切割：将提取得到的DNA样本与适当的限制性内切酶一起反应，使得DNA分子在特定的酶切位点被切割成多个较小的片段。

这样做的目的是得到较小的DNA片段，方便后续的克隆和测序。

3. DNA片段克隆：将切割后的DNA片段克隆到合适的载体中，如质粒。

这可以通过PCR扩增、DNA连接等方法进行。

克隆得到的DNA片段形成了一个个克隆子，每个克隆子都携带着一个特定的DNA片段。

4. Sanger测序：对克隆得到的DNA片段进行测序。

通常采用Sanger测序技术，利用特殊的引物、有色荧光基团和催化测序反应来测定DNA片段的序列。

这个过程会产生一系列不同长度的读取片段，从而获得DNA片段的测序结果。

5. 序列拼接：根据Sanger测序结果，通过比对、重叠匹配等算法将不同的DNA片段拼接起来，得到整个基因组序列。

三、分析全基因组测序逐步克隆法具有如下几个优点和局限性：优点：1. 可以测定整个生物体的基因组序列，提供全面的遗传信息。

HBV 全基因克隆一病毒DNA的提取1.在1.5ml螺旋盖塑料离心管加入480μl病毒DNA out溶液。

2.加入160μl血清样品，彻底振荡30s混匀后室温放置10min。

3.再振荡30s混匀，加入560μl异丙醇，振荡30s，15000g室温离心15min，带管盖柄的方向一致向外。

4.先用1ml移液枪遗弃上清，分两次吸取（注意不要触及沉淀或者让吸起的液体污染枪），留少量液体，再短暂离心1min，用100-200μl移液枪小心地弃所有残留液体，此步作用尽量去除液体中杂蛋白。

5.加入800μl 70%的乙醇，轻柔颠倒混合3次，不要摇散底部沉淀，然后15000g室温离心5min，按照4的方法分两次遗弃上清，此步作用在于去除残留异丙醇和盐分。

6.开盖8min蒸发，使DNA更易于融解于水，此时加入80μl Tris缓冲液，等待2-3min，使沉淀变得松散，用移液枪吹打管壁和管底的膜状沉淀，使其融解。

7.15000g离心1min后，-20℃保存。

二 HBV全长基因组的扩增Sense primer F1:5--CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCTTTTTCACCTCTGCCTAATCA--3’（1821-1841）antisense primer R1:5--CCGGAAAGCTTGAGCTCTTCAAAAAGTTGCATGGTGCTGG-- 3’（1825-1806）引物设计合成以HBV负链开口处序列为起始点，引物3’末端最后一个碱基硫代磷酸化修饰（抵抗Pfu的3’－5’外切酶活性），引物包含Sal I与Not I酶切位点。

PCR反应液组成，20μl体系如下：(两管共计40μl)10×LA PCR Buffer 2μl2.5mmol/L dNTP Mixture 1.6μl1/5 F1(25μmol/L) 1μl1/5 R1(25μmol/L) 1μlTaKaRa LA Taq (5U/μl) 0.4μl蒸馏水 4μlDNA模板 10μlPCR的循环参数：94℃ 5min94℃ 40s, 60℃ 1min40s, 72℃ 4min 共35个循环72℃ 7min 4℃ forever三 PCR产物的加A与回收TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）即利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。

U PT OOF F40% 卓越速度 触手可及基因克隆实验流程特惠活动时间：2011年2月1日-4月30日特惠活动时间：2011年2月1日-4月30日© 2011 Roche Diagnostics LimitedS A LE如需订货或是了解本次活动详情，请联系我们免费订货热线: 800-820-3361 400-820-3361技术咨询: 800-820-0577 | *********************传真*************邮箱:******************更多优惠活动，请登陆罗氏网站查询/specials 本次活动最终解释权归罗氏应用科学部。

40% Off PCR 扩增试剂盒40% Off DNA 分离纯化试剂盒40% Off 克隆产品Up to 40% Off X-tremeGENE 转染试剂20% Off cOmplete ULTRA 蛋白酶抑制剂40% Off 逆转录产品上海市淮海中路1045号淮海国际广场12楼 邮编: 200031Tel: +86 21 3397 1000Fax: +86 21 3397 1188订货热线：800-820-3361 400-820-3361技术服务：800-820-0577|*********************邮箱：******************罗氏诊断产品(上海)有限公司罗氏应用科学部北京市东城区东长安街1号东方广场东方经贸城中二办公楼六层09室 邮编: 100738Tel: +86 10 8515 4100Fax: +86 10 8515 4188北京广州市环市东路403号广州国际电子大厦25楼邮编: 510095Tel: +86 20 8713 2600Fax: +86 20 8713 2700广州基因克隆实验流程手动核酸分离纯化目标核酸类型原始样本实验用时产量/得率推荐产品DNA 片段PCR 混合物, 限制性酶切产物, 琼脂糖凝胶切片, 经标记和修饰的反应混合物10 min5 -25 µg 大于 100 bp DNA 的回收率> 80% High Pure PCR Product Purification Kit 回收率> 85% ，最高可回收20 µg DNA High Pure PCR Cleanup Micro Kit 放射性标记的 DNA, 去除多余的荧光标记终止子7 min20 - 75 µl 标记混合物的回收率 > 80%mini Quick Spin DNA Columns质粒 DNA E. coli 质粒30 min2ml E. coli XL1菌液可分离pUC19质粒DNA 达 12 µg High Pure Plasmid Isolation Kit 60 min 30 ml E. coli DH5α 菌液可分离pBS 质粒DNA> 85 µg Genopure Plasmid Midi Kit 75 min150 ml E. coli XL1 blue 菌液可分离pUC19质粒DNA> 420 µgGenopure Plasmid Maxi Kit基因组DNA组织、培养细胞、细菌、酵母、血20 - 200 min ,取决于样本来源 3 - 20 µg ,取决于样本来源High Pure PCR Template PreparationKit哺乳类/人血1.5 hour ，不含重悬时间570 µg ，从10ml 鼠/兔全血浆中分离DNA Isolation for Mammlian Blood DNA 片段琼脂糖凝胶切片60 min0.4 - 9.5kb 的DNA 片断回收率为80%Agarose Gel DNA Extraction Kit产品选择指南更多信息，欢迎登录：/sis/napure核酸分离纯化■节省时间 – 更短的时间处理更多的样本。

基因克隆原理及实验介绍基因克隆是一种将一段特定的DNA序列从一个生物体复制到另一个生物体中的实验技术。

通过基因克隆，科学家们可以研究和分析特定基因的功能以及其在生物体中的作用。

基因克隆的原理主要包括DNA片段的选择、DNA片段扩增、构建载体、插入DNA片段到载体中、转化宿主细胞、筛选并鉴定重组表达体等步骤。

首先，基因克隆的第一步是选择目标DNA片段。

目标DNA片段可以是一个完整的基因、一个局部的基因片段，或者是其他DNA序列。

选择DNA片段通常基于对目标基因的兴趣或研究目的。

接下来，将目标DNA片段通过PCR扩增技术获取足够数量的DNA。

PCR是一种可以在体外扩增特定DNA片段的方法，它使用DNA聚合酶酶和合成的两个引物来扩增特定的DNA序列。

PCR的结果是通过DNA的指数增长，可以获得足够数量的DNA用于后续的实验。

在获得足够的DNA片段之后，下一步是构建载体。

载体是一个DNA分子，可以用来携带和复制目标DNA片段。

最常用的载体是质粒，质粒是一种环状的DNA分子。

构建载体的过程包括选择合适的质粒，将质粒进行消化（通过限制酶切），然后使用DNA连接酶将目标DNA片段连接到质粒上。

之后，构建好的载体需要插入到宿主细胞中。

细菌通常是最常用的宿主细胞，因为它们可以快速增殖并很容易被转化。

一种常用的转化方法是热激转化法，即将含有质粒的细胞和热激转化液一同加热，使得质粒能够进入细菌细胞内。

转化成功后，需要对宿主细胞进行筛选并鉴定是否有重组表达体。

最常用的筛选方法是利用抗生素抗性基因。

在构建载体的过程中，通常会将抗生素抗性基因插入到质粒中，使得只有带有重组表达体的细菌能够在含有抗生素的培养基上存活和生长。

最后，使用一系列的分子生物学方法，如限制酶切、PCR、DNA测序等，对得到的重组表达体进行鉴定和验证。

这些方法可以确定插入的DNA 片段是否正确，并且确认重组表达体是否具有所需的功能。

总之，基因克隆是一种强大的实验技术，可以用于研究和分析特定基因的功能和作用。

基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。

获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。

该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。

原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。

2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。

此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。

因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。

3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。

在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。

4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。

用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。

用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。

二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。

为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。

原核或真核细胞基因克隆的实验方案
基因克隆是指将一个生物体的基因序列复制并导入到另一个生物体中。

下面是一个原核或真核细胞基因克隆的实验方案的概述：
原核细胞基因克隆实验方案如下：
1. 选择一个合适的质粒(vector)，如pUC19。

2. 从原核细胞中提取目标基因的DNA序列。

3. 将目标基因的DNA序列连接至质粒上的适当限制酶切位点，形成重组质粒。

4. 将重组质粒转化至宿主细菌中，如大肠杆菌。

5. 在含有适当选择性培养基的培养皿中培养转化后的细菌。

6. 通过筛选克隆检测获得目标基因被成功插入质粒的细菌。

7. 最后，提取重组质粒中的目标基因。

真核细胞基因克隆实验方案如下：
1. 选择一个合适的真核细胞载体(vector)，如pCDNA3.
2. 将目标基因的DNA序列放入真核细胞载体中，形成重组载体。

3. 将重组载体转染入真核细胞中，如哺乳动物细胞。

4. 在培养基中培养转染后的真核细胞。

5. 筛选和收集含有目标基因的克隆细胞。

6. 验证克隆细胞中目标基因的存在，如通过PCR或DNA测序等方法。

7. 最终，可通过克隆细胞培养、提取目标基因的方式获得目标基因。

在进行任何实验操作前，请确保遵守实验室的安全规范和伦理要求，并获得相应的研究伦理审批。

1总RNA提取(1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷(3) 加200 µL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层；(4) 4o C，12,000g，离心15 min；(5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min；(6) 4o C，12,000g，离心10 min；(7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗(8) 4o C，7,500g，离心5 min；(9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。

此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。

提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。

OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。

RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（µg/mL）=A260×稀释倍数×40。

2反转录/cDNA第一链的合成纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。

其体系为：Total RNA1μg5× gDNA Eraser Buffer2μLgDNA Eraser1μLRNase Free dH2O补齐至10μL 条件为：42o C，2min；RNA纯化后，即可进行反转录。

其体系为：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μLPrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μLRT Primer Mix 1μL上一步的反应液10μLRNase Free dH2O补齐至20μL 操作条件为：(1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。

一、实验目的1. 学习并掌握基因克隆的基本原理和操作方法。

2. 掌握基因纯化的实验技术。

3. 熟悉实验器材和试剂的使用。

二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，形成重组DNA分子，并使其在宿主细胞中复制和表达。

基因纯化是指从复杂的混合物中提取目的基因片段，并去除其他非目的物质。

本实验以人颗粒酶B基因为例，进行克隆和纯化实验。

三、实验材料1. 实验器材：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、培养箱等。

2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、Taq酶、载体、质粒提取试剂盒、琼脂糖、DNA marker、Tris-HCl缓冲液、NaCl等。

四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）提取肿瘤组织中的淋巴细胞，抽提RNA。

（2）以RNA为模板，进行RT-PCR，扩增人颗粒酶B基因全长。

（3）将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

2. 重组质粒的构建（1）将扩增产物与pGEX24T21载体进行连接。

（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，进行菌落培养。

（3）挑选阳性克隆，进行PCR验证。

3. 重组质粒的鉴定（1）提取重组质粒，进行限制性内切酶酶切。

（2）进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

（3）对阳性克隆进行DNA测序，验证基因序列的正确性。

4. 重组质粒的表达与纯化（1）将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，进行菌落培养。

（2）以IPTG诱导重组质粒表达。

（3）进行SDS-PAGE电泳，观察表达产物。

（4）采用Ni亲和树脂对表达产物进行纯化。

5. 纯化产物的鉴定（1）对纯化产物进行SDS-PAGE电泳，观察结果。

（2）对纯化产物进行Western blot分析，验证其特异性。

五、实验结果与分析1. RT-PCR扩增结果：成功扩增出人颗粒酶B基因全长。

2. 重组质粒构建结果：成功构建了pGEX2GrB重组质粒。

3. 重组质粒鉴定结果：限制性内切酶酶切结果与预期相符，DNA测序结果与GenBank数据库中的人颗粒酶B基因序列一致。

基因克隆主要过程一、基因克隆概述基因克隆是指将一个细胞中的某个基因序列复制并转移到另一个细胞中，从而使目标基因得以表达。

基因克隆的过程包括：选择适当的宿主细胞、构建载体、将目标基因插入载体中、转化宿主细胞、筛选转化成功的细胞并培养、分离纯化目标基因等步骤。

本文将对这些过程进行详细的介绍。

二、选择适当的宿主细胞选择适当的宿主细胞是基因克隆的第一步。

通常情况下，常用的宿主细胞包括大肠杆菌、酵母等。

选择宿主细胞的标准主要包括以下几个方面：1.易于培养：宿主细胞应具备简单、廉价、高效的培养条件，以便进行大规模的培养和筛选。

2.安全性：宿主细胞不应具备对人体有害的特性，以免对生物安全造成威胁。

3.生长速度：宿主细胞应具备较快的生长速度，以便加快基因克隆的进程。

三、构建载体在基因克隆中，常用的载体有质粒、病毒和人工染色体等。

构建载体的主要目的是将目标基因插入到载体中，并确保其能够被宿主细胞所识别和复制。

构建载体的步骤如下：1.获取载体：从自然界或者实验室中获取合适的载体，并通过酶切和连接等技术进行改造。

2.插入目标基因：将目标基因与载体进行连接，一般通过限制性酶切和连接酶的作用，将目标基因与载体的开放的端部连接。

3.反选：通过选择适当的标记（如抗生素耐药性基因）进行反选，以筛选出成功插入目标基因的载体。

四、将目标基因插入载体中将目标基因插入载体中是基因克隆的核心步骤，常用的方法有PCR扩增插入法、限制性内切酶法和电泳法等。

1. PCR扩增插入法PCR扩增插入法是目前常用的一种方法。

具体步骤如下：1.PCR扩增：使用PCR技术将目标基因的DNA序列扩增得到线性DNA片段。

2.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割成开放的线性片段。

3.连接：将扩增得到的目标基因片段与载体线性片段进行连接，需注意连接时选择合适的限制性内切酶。

2. 限制性内切酶法限制性内切酶法是较为传统的方法，也是基因克隆中常用的一种方法。

具体步骤如下：1.载体切割：使用限制性内切酶将载体切割为开放的线性片段。

转录组序列基因克隆
转录组序列基因克隆是一种用于从转录组数据中克隆基因的方法。

以下是一般的步骤：
1. 获得转录组数据：通常通过 RNA 测序（RNA-seq）技术获得转录组数据。

这些数据提供了有关细胞或组织中表达的所有 RNA 分子的信息。

2. 筛选目标基因：根据研究的目的，从转录组数据中筛选出感兴趣的目标基因。

这可以基于特定的表达模式、功能注释或其他相关的生物信息学分析。

3. 设计引物：针对目标基因的序列，设计特异性的引物用于 PCR 扩增。

4. PCR 扩增：使用设计的引物，从转录组数据对应的 cDNA 文库中进行 PCR 扩增。

这将产生目标基因的特定片段。

5. 克隆和测序：将 PCR 扩增的产物克隆到适当的载体中，并进行测序以确认所克隆的序列的准确性。

6. 功能分析：对克隆的基因进行进一步的功能分析，例如表达分析、蛋白质表达和功能研究等。

需要注意的是，转录组序列基因克隆的成功与否取决于许多因素，包括转录组数据的质量、引物的设计、PCR 条件等。

在进行该方法之前，建议对相关技术和实验步骤有一定的了解，并根据具体情况进行优化和调整。