第三章基因工程
第一节重组DNA技术的基本工具
基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
一、分子手术刀—限制性内切核酸酶
1.全称和简称
全称：_限制性内切核酸酶_
简称：__限制酶_
2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的
3.作用：
①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。
①使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__
5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由
_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和
__平末端__。
（1）EcoR①限制酶切割
EcoR①识别序列为GAATTC
EcoR①切割部位为GA之间的磷酸二酯键
（2）Sma①限制酶切割
Sma①识别序列为CCCGGG
Sma①切割部位为CG之间的磷酸二酯键
二、分子缝合针—DNA连接酶
1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。
2.
种类E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶
来源大肠杆菌T4噬菌体
特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端
作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
3
名称作用部位作用底物作用结果
限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段
DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶或热
稳定DNA聚合酶
磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端
三、分子运输车——载体
1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
2.种类：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
3.作为载体需具备的条件
①_有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中__；
②_能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上，随受体DNA同步复制_；
③_常有特殊的标记基因，便于重组DNA分子的筛选_；
④_对受体细胞无害_。
探究.实践：DNA的粗提取与鉴定
1.提取思路：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面存在的差异，选用
适当的物理或化学方法对他们进行提取。
2.提取原理：
①DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精，利用这一原理，可以初步分离DNA与蛋
白质；
②DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液。
3.鉴定原理：在一定温度下（沸水浴），DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色，因此二苯胺试剂
可以作为鉴定DNA的试剂。
4.比较DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
溶解规律 2 mol/L NaCl溶液0.14 mol/L NaCl溶液DNA溶解析出
5．DNA 粗提取中的注意事项
（1）本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞 无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作材料。
（2）加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫。加入酒精 和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA 分子的断裂，导致DNA 分子不能形成絮状沉淀 。 （3）二苯胺试剂要现配现用 ，否则会影响鉴定的效果。
（4）提取植物细胞的DNA 时，加入的洗涤剂能溶解细胞膜 ，有利于DNA 的释放；加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA 。
（5）在DNA 进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精 的作用是溶解杂质和析出DNA 。
第二节 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的筛选与获取 （一）目的基因的筛选与获取 1.目的基因概念
在基因工程的设计和操作中，用于__改变受体细胞性状__或__获得预期表达产物_等的基因就是目的基因（根据不同的需要，目的基因是不同的，主要是指__编码蛋白质的基因___）。 2.筛选目的基因的方法
（1）从相关的__已知结构__和__功能清晰__的基因中进行筛选。 （2）获取方法⎩⎪⎨⎪
⎧
从基因文库中获取利用PCR 技术扩增
通过化学方法人工合成
3.利用PCR 获取和扩增目的基因
（1）PCR 的概：PCR 是__聚合酶链式反应__的缩写，是一项根据_DNA 半保留复制_的原理，在_体外_提供参与DNA 复制的__各种组分__与_反应条件_，对_目的基因的核苷酸序列_进行__大量复制__的技术。 ①全称：__聚合酶链式反应___ ②原理：___DNA 半保留复制___
③操作环境：__体外（PCR 扩增仪/PCR 仪）___
④目的：__对目的基因的核苷酸序列进行大量复制___ ⑤优点：___可以在短时间内大量扩增目的基因___ （2）DNA 体内复制的条件
参与的组分
在DNA 复制中的作用
DNA 母链 提供DNA 复制的模板 4种脱氧核苷酸 合成DNA 子链的原料 解旋酶 打开DNA 双链 DNA 聚合酶 催化合成DNA 子链
引物
使DNA 聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸
注：引物是一小段能与_DNA 母链__的一段碱基序列__互补配对_的_短单链核酸__。
