分子细胞生物学技术

单抗大量制备方法
• （1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获 取单克隆抗体。 • （2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清 ①实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小 鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后 （一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆 ②腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液体 石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种 细胞7～10天后可产生腹水
原理：
• 细胞的选择与融合 • 选择培养基的应用
Baidu Nhomakorabea一)细胞的选择与融合
融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的B细胞，通常来源于免 疫动物的脾细胞。 融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不断增殖， 只有肿瘤细胞才具备这种特性。 选择同一体系的细胞可增加融合的成功率。多发性骨髓瘤是B 细胞系恶性肿瘤，所以是理想的脾细胞融合伴侣。 聚乙二醇(PEG1 000～2 000)是目前最常用的细胞融合剂， 一般应用浓度为40%(W/V)。
• HAT培养基培养细胞混合液7-10天： 在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天 后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10 天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。
杂交瘤的克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过 HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际 工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、 抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无 关抗体的分泌细胞。 1．有限稀释法克隆 2．软琼脂培养法克隆
单克隆抗体的鉴定
• 1．抗体特异性的鉴定 • 2．McAb的Ig类与亚类的鉴定 • 3．McAb中和活性的鉴定 • 4．McAb识别抗原表位的鉴定 • 5．McAb亲合力的鉴定
杂交瘤技术 （hybridoma technique）
李特 细胞生物学
杂交瘤技术
1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自 然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在 体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后 的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细 胞易于在体外无限增殖的特性，又具有合成和分泌特异 性抗体的特点。
(二)选择培养基的应用
细胞融合是一个随机的物理学过程，在小鼠脾细胞和小鼠骨 髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现： ①脾细胞 ②瘤细胞 ③脾细胞/瘤细胞 ④脾细胞/脾细胞 ⑤瘤细胞/瘤细胞 正常的脾细胞在培养基中仅存活5～7d，无需特别筛选；细胞的多 聚体形式也容易死去；而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除
细胞DNA合成一般有两条途径： 从头合成途径：甲氨蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常 途径合成DNA； 另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄 嘌吟磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用 合成DNA。 细胞融合的选择培养基中有3种关键成分：次黄嘌呤 (hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核 苷(thymidine，T)，所以取三者的字头称为HAT培养基。