人表皮生长因子的纯化及浓度在线检测

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人表皮生长因子的纯化及浓度在线检测

童望宇1, * , 姚善泾2, *

, 朱自强2

(1上海市华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海市 200237;

2浙江省杭州市浙江大学化学工程与生物工程系,杭州 310027)

摘要 在分离纯化快速开拓系统(ÄKTA explorer 100)中用凝胶(Sephadex G-50 superfine )纯化人表皮生长因子,并在优化条件下对其纯化过程中的hEGF 进行定量测定。用标准人表皮生长因子经离子交换柱、蛋白质扫描分析系统及SDS-PAGE 间相互印证,结果表明:在优化条件下,可得到在SDS-PAGE 上与标准样品hEGF 一样清晰的单条带,其产品纯度高于94%,回收率高于36%;其检测的灵敏度可达1μg/ml 。该法不仅对人表皮生长因子的在线检测行之有效,而且对其它蛋白质纯化的在线检测也具有参考价值。

关键词 人表皮生长因子,层析,检测,纯化

中图分类号 TQ0333 Q819

引言

人表皮生长因子(human epidermal growth factor ,hEGF )是由53个氨基酸残基所组成

的多肽生长因子,分子量约为6200D [1]。人表皮生长因子具有在体内刺激皮肤组织、角膜、肺、气管上皮组织的生长繁殖及抑制胃酸分泌等多种生物学作用,因而可应用于外科伤口的愈合及溃疡病的治疗等医疗领域[2-5]。自1975年Cohen 等人[1]从尿液中首先分离纯化得到人表皮生长因子以来,有关研究的进展很快,除了继续研究从天然来源中分离纯化以外,基于基因工程菌发酵生产也已问世[6-7],但是不管是从天然资源,还是来自基因工程菌发酵液,hEGF 的浓度总是偏低,需要经过较长时间的分离和纯化流程,才能得到相对较纯的产品。为了设计一个高效和可控的纯化过程,hEGF 的在线分析和检测就成为非常重要。

目前,hEGF 的定量检测方法主要有放射免疫分析(Radio immuno-assay, RIA )[4]、放

射受体分析(Radio receptor assay, RRA) [8]、酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA )[9]、酶免疫分析(Enzyme immunoassay, EIA )[10]、反相HPLC [11]和免疫荧光技术[12]等。以上各种方法均有其特点和不同的条件局限性,但均难用于过程的在线检测。

我们在使用ÄKTA explorer 100进行蛋白质纯化时发现,该系统通过本身带有的软件,

不仅可以与各种层析柱结合进行多种生物质的分离流程研究,而且还可以比较精确地通过出峰面积表示蛋白质量的多少。利用这种定量关系,就为定量确定生物质含量提供了基础。以此为依据,对hEGF 这个比较难于定量与分离的多肽,进行了凝胶层析中在线检测与纯化工艺的优化,达到了纯化与在线定量检测的目的。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

联系人:童望宇,姚善泾, E-mail: tongwy@ , yaosj@

第一作者:童望宇,男,40岁,博士

* 国家自然科学基金资助项目(批准号:29736180)

_______________________________________________________________________________

分离纯化快速开拓系统(ÄKTA explorer 100)、进样柱(Superloop TM 50)、层析柱(XK 16/20)、离子交换预装柱(RESOURCE Q6)、凝胶(Sephadex G-50 superfine)、蛋白质扫描分析系统(Image Master VDS Video Documentation System)购自Amersham Pharmacia Biotech AB. Sweden;电泳仪(Mini VE complete)购自Amersham Pharmacia Biotech Inc., USA;hEGF 标准品购自Pepro Tech EC Ltd, England。其它试剂均为市售的分析纯试剂。

平衡液:pH 7.0,0.02M的磷酸缓冲液(PBS);

洗脱液:pH7.0 PBS+2 M NaCl的磷酸盐缓冲液。

1.2 样品的预处理

将含有hEGF的发酵液[13]经冷冻离心机进行离心(8000rpm,10min, 4 0C),收集上清液,取该上清液1000 ml,用1M浓度的盐酸小心调发酵液的pH于4.6左右,缓慢加入210 g硫酸铵(硫酸铵饱和度为:35%),搅拌溶解,4 0C下静置4~24小时,至沉淀彻底,人表皮生长因子进入沉淀中。虹吸去除700~850 ml上清液,剩余的150~300 ml于4 0C条件下8000 rpm、20 min离心,收集沉淀。用100 ml 平衡液搅拌溶解沉淀,形成悬浊液,4 0C下静置4~24小时,待溶解充分后,于4 0C下8000 rpm、20 min离心,收集上清液,于4 0C 下保存备用。

1.3 hEGF的定性分析

hEGF的定性分析用SDS-PAGE电泳[14]。

1.4 hEGF的定量分析

1.4.1 实验原理

在蛋白质及多肽分子中,酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸等芳香氨基酸的苯环含有共轭双键,因而具有吸收紫外线的性质,吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内,蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其含量呈正比例关系(m =f ×A,式中m为蛋白质的含量,f 为比例系数,A为峰面积),由此可用作总蛋白质及被纯化蛋白质的定量测定。

1.4.2 实验设计

对待测浓度的目标蛋白,可先用标准样品在相同层析条件下确定其保留值,再用其它方法给予验证,为定量分析提供基础。不同样品的组成各不相同,实验中应尽可能优化层析条件,扩大目标产物与其它组成的保留值差距以提高检测的准确性。由于ÄKTA explorer 100能够提供相应正确的峰面积与蛋白质定量关系,因此在hEGF的纯化中,将其与凝胶柱结合,并在优化条件下,进行hEGF的纯化与在线检测,然后再配以SDS-PAGE及蛋白质扫描分析系统的进一步印证。使得分析的可信度大为提高。

2 结果与讨论

2.1 hEGF标准曲线的制定

为考察ÄKTA explorer 100紫外检测仪的灵敏度及紫外吸收峰面积与蛋白质浓度的关系。实验选用了RESOURCE Q6强阴离子预装柱,用Unicorn3.0所推荐的模板[15]经空柱(bypass)流程对多种标准蛋白质进行了多浓度水平反复验证,并用牛血清白蛋白标准品共进行了5次μg/ml级重复测定,其标准偏差为0.9948。在此基础上,采用了浓度为2μg/ml hEGF 的标准hEGF,分别用1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0ml的体积进样,测试其峰面积与进样量的关系,结果如图1、2所示。